绿僵菌Argonaute基因片段原核表达载体的构建及其表达

绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌.研究表明小RNA能够调控基因的表达,其中Argonaute基因在整个小RNA通路中发挥重要的作用.本研究通过RT-PCR的方法从绿僵菌中获得了Argonaute基因的部分功能片段,构建了其重组原核表达载体,将重组载体转化至大肠杆菌进行诱导表达;采用镍柱亲和纯化重组的目的蛋白并通过Western blot技术鉴定.结果发现：通过RT-PCR的方法获得长度约为950bp的基因片段;重组原核表达载体经诱导表达后,SDS-PAGE检测发现分子量约为34kDa的目的蛋白条带;诱导5h后蛋白的表达量最高,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,经Western blot技术检测,重组蛋白可与His-tag抗体发生特异性反应.该纯化重组蛋白的获得为将来绿僵菌Argonaute蛋白抗体的制备,并进一步通过该抗体获得绿僵菌体内的小RNA及其靶基因提供了基础.     

弓形虫主要表面抗原1截短型片段的克隆与表达

为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR) 从弓形虫RH 株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性.     

柑橘黄龙病菌CpaB基因的原核表达和抗体制备

柑橘黄龙病菌CpaB基因编码一种菌毛组装蛋白(Flp pilus assemble protein),前期研究已经证实该蛋白具有外分泌性.在本研究中,首先构建pET30a-CpaB重组载体,然后将其转化BL21(DE3)感受态细胞,重组菌在37℃,0.2 mmol·L^(-1) IPTG诱导下,CpaB蛋白可被成功诱导表达,经过Ni-NTA亲和柱纯化后,获得纯度较高的CpaB重组蛋白,分子量为28.2 kDa,以其为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗血清;采用Western blot对多抗血清的特异性进行分析,结果显示该多抗能特异性结合纯化的CpaB蛋白;进一步使用制备好的CpaB抗血清对感染黄龙病和健康的柑橘样品进行DTBIA检测,具有较好的区分度.这些研究结果为柑橘黄龙病快速检测体系的建立提供理论参考.     

弓形虫主要表面抗原1截短型片段的克隆与表达

为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与GenBank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性.     

人C6orf210基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。     

细胞应激和氧化还原活性蛋白参与硫氧还蛋白-1高表达幽门螺杆菌感染所致胃黏膜的癌变（英文）

目的:探索高表达硫氧还蛋白-1(Trx1)的幽门螺杆菌在致胃黏膜癌变过程中的作用机制。创新点:首次分析临床分离菌株感染蒙古沙土鼠的胃黏膜疾病动物模型,首次对不同菌株感染所致的胃黏膜癌变相关分子机制进行探索。方法:用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)蛋白质组学及生物信息学分析方法进行分析,并用免疫印迹法(Western blot)对重要分子进行验证。结论:高表达Trx1的幽门螺杆菌在致胃黏膜癌变过程中,三个重要的细胞应激和氧化还原活性蛋白包括14-3-3α/β、谷胱甘肽转移酶(GST)和热休克蛋白(HSP70)参与致病。     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

将人细胞周期蛋白D1基因克隆入原核表达载体pET-20b中获得重组质粒pET-20b-eyeD,经酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21PlaysS后获得表达菌株．该菌株经IPTG诱导后表达的目的蛋白有部分分泌到培养基上清中,将培养基上清中的蛋白沉淀后用Ni^2＋螯合柱进行纯化,最后可得到纯度达到95％以上的目的蛋白．蛋白电泳显示纯化蛋白的分子量约为33KD,Westemblot分析表明,在电泳胶的相应分子量处出现特异性条带,说明已经成功表达和纯化了重组人细胞周期蛋白D1．     

大型溞胆碱酯酶蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和适用性研究（英文）

目的:原核表达并纯化大型溞胆碱酯酶(ChE),制备鼠抗大型溞ChE多克隆抗体,并对抗体的适用性进行研究。创新点:首次通过原核表达获得了大型溞重组ChE蛋白,通过免疫小鼠获得了高效价、高特异性的多克隆抗体,通过样品检测证明了抗体的适用性。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)技术获得大型溞ChE基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体p ET-29a(+),构建重组表达质粒p ET-ChE,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达;对表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶活性检测,并对蛋白进行纯化(图4);使用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体(图5),用酶联免疫吸附分析法(ELISA)对处于三唑磷和低温胁迫下以及经反复冻融处理的大型溞体内的ChE含量变化进行检测(图7、表6和7),以评价抗体的可适用性。结论:获得了高纯度的ChE重组蛋白;免疫小鼠后,获得了特异性强、高效价的抗体;通过对处于三唑磷和低温胁迫下以及经过反复冻融处理的大型溞体内的ChE含量的检测,证明了抗体的适用性。     

昆虫神经毒素AaIT原核表达、纯化及抗体制备

人工合成Aa IT的成熟基因,连接到p ET32载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化重组Aa IT蛋白并免疫小鼠,经蛋白质-G柱对抗血清进行纯化.研究结果表明,纯化得到了Aa IT蛋白经免疫小鼠和纯化抗血清得到了特异性强的Aa IT抗体蛋白.     

高致病性禽流感H5N1血凝素蛋白表达及活性测定

通过PCR扩增高致病性禽流感H5N1的HA和HA1基因片段,利用原核表达系统表达重组HA和HA1蛋白,并用SDS-PAGE,Western-blotting和血凝试验进行重组HA蛋白的鉴定和血凝活性鉴定.结果表明,经过HA蛋白胞外段分析、重组载体的酶切鉴定得出的重组HA蛋白,在血凝试验中能与HA特异性抗体结合,并有较高的血凝活性.利用表达载体pET42a表达AIV-H5亚型的HA基因,为进一步利用重组蛋白研制AIV-H5抗体的ELISA检测方法,研制抗AIV-H5亚型的单克隆抗体提供基础.     

绿色荧光蛋白的原核表达和纯化及鉴定的实验设计与实践

该文以绿色荧光蛋白FRP为实验对象,通过设计原核蛋白表达、镍柱亲和纯化、荧光光谱分析、SDSPAGE电泳分离、Western blotting免疫印迹及蛋白质质谱鉴定等内容的生物化学综合实验,提高学生的生物化学实验技能。荧光光谱分析表明,纯化的GFP蛋白的最大激发波长为480nm,最大发射波长为500nm,与已知的GFP荧光光谱基本相同。SDS-PAGE电泳分离发现,GFP的亲和纯化效果好,且纯化得到的GFP分子量约为27kDa,与理论值相符。该实验适用于生物科学专业本科生系统完整地学习蛋白质表达、纯化和鉴定的实验方法,具有很好的综合性,取得非常好的教学效果。     

一种嵌合式DNA聚合酶的表达及功能验证

为了建立一套基于大肠杆菌表达系统的嵌合式高保真DNA聚合酶的重组表达与纯化的工艺,首先将含有目的基因的质粒转化至大肠杆菌BL21中,通过高压破碎仪进行细胞破碎,再用离子交换层析方法获得嵌合型高保真聚合酶。优化反应条件显示在28℃自动诱导下表达的嵌合DNA聚合酶蛋白产量较高。利用高压破碎仪将细胞破碎获得可溶蛋白,然后利用硫酸铵沉淀将蛋白粗纯,并采用离子交换层析柱纯化,最终获得较纯的DNA聚合酶。通过对获得的嵌合DNA聚合酶进行活性分析,证实该聚合酶具有高效的活性,为以后大规模生产高保真DNA聚合酶奠定基础。     

猕猴桃抗菌肽截短体原核表达载体的构建

抗菌肽是生物体先天防御系统中的多肽,协助机体抵御外源微生物的侵害.天然抗菌肽提取难度大,不利于其开发利用,其旨在探究猕猴桃抗菌肽体外高效制备方法.本研究通过生物信息学方法进行序列分析与基因克隆合成猕猴桃截短体抗菌肽(Truncated Antimicrobial Peptide,TrAMP)序列,并将其连接到原核表达载体pET-47b(+)+Fa-AMP上,转化获得其BL21(DE3) pLysS工程菌,经PCR和测序鉴定,表明重组表达载体构建成功,并经生物信息学模型预测显示抗菌肽具有抑菌活性,为进一步研究猕猴桃抗菌肽体外诱导表达及生物学功能验证奠定基础.     

硫化氢通过抑制NF-κB信号通路对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的炎症反应起到缓解效果（英文）

目的:硫化氢(H_2S)具有抗氧化和抗炎反应的作用,但是在DSS诱导的结肠炎模型中的研究鲜有报道。因此,本文采用小鼠和人结肠上皮细胞系Caco-2为实验模型,研究了H_2S在DSS诱导的炎症模型中的缓解效果。创新点:(1)本研究采用体内和体外模型分别对H_2S对DSS诱导的炎症缓解效果进行了验证,结果发现H_2S具有抗炎作用;(2)本研究发现H_2S能够抑制核转录因子κB(NF-κB)信号通路,从而对炎症起到缓解作用。方法:采用DSS建立小鼠结肠炎模型,腹腔注射H_2S供体硫化氢钠(NaHS);采用DSS诱导Caco-2炎症,然后处理H_2S供体NaHS。收集小鼠结肠组织和细胞,进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)分析炎症基因和NF-κB表达情况。结论:H_2S对DSS诱导的体内和体外炎症反应具有一定的缓解作用,其机制可能是通过影响了NF-κB信号通路。     

抑癌基因PTEN载体构建及在LOVO细胞中的表达

目的:构建抑癌基因PTEN的表达载体并在LOVO细胞中表达。方法:从人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出PTEN基因片段,将PTEN基因连入pLenti6/V5载体。测序鉴定后,经脂质体转染入LOVO细胞,对细胞株进行RT-PCR和Western blot检测。结果:DNA测序证实pLenti6/V5-PTEN表达载体为阳性克隆;该表达载体转染LOVO细胞后上调了PTEN mRNA和蛋白的表达。结论:成功构建了pLen-ti6/V5-PTEN表达载体,为进一步研究PTEN在LOVO细胞中的功能奠定了基础。     

用高度特异性王浆主蛋白1多克隆抗体ELISA法检测蜂王浆新鲜度(英文)

目的:为蜂王浆主蛋白1(MRJP1)的快速检测和鉴别提供科学依据,为蜂王浆的质量控制提供技术支持。创新点:首次比较了MRJP1特异性多克隆抗体与MRJP1重组表达蛋白多克隆抗体对王浆主蛋白家族的免疫反应差异,验证了蜂王浆中MRJP1蛋白降解与保温时间的相关性,建立了以MRJP1作为蜂王浆新鲜度生物标志物的快速检测方法。方法:通过蜂王浆主蛋白家族蛋白的氨基酸序列同源性分析,筛选出MRJP1的特异性多肽区域,进行人工合成,免疫兔子后取血清制备成特异性多克隆抗体。用蛋白质印迹法(Western blot)检测了MRJP1特异性多克隆抗体与MRJP1重组表达蛋白多克隆抗体对王浆主蛋白家族的免疫反应。以新鲜蜂王浆为对照品,用MRJP1特异性抗体酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)法和变性电泳胶灰度扫描法分别测定保温(40°C)7~49天的蜂王浆中MRJP1含量的变化,并进行了相关性分析。结论:MRJP1的特异性抗体对MRJP1蛋白具有专一的免疫识别特性,可特异性地检测代表蜂王浆新鲜度的MRJP1含量变化,并鉴别蜂王浆的真伪。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白通过未折叠蛋白反应诱导凋亡（英文）

目的:确定猪圆环病毒2型衣壳蛋白(PCV2)感染引起未折叠蛋白反应的关键病毒蛋白,以及探究PCV2感染中未折叠蛋白反应与凋亡之间的联系。创新点:本文首次鉴定出PCV2感染引起未折叠蛋白反应的关键病毒蛋白。方法:构建表达病毒蛋白的真核表达载体,通过瞬时转染PK-15细胞,采用免疫印迹检测未折叠蛋白反应通路的关键分子;利用RNA干扰抑制perk基因的表达来验证激活的通路;通过抑制内质网上游分子PERK并利用免疫印迹和流式细胞术检测凋亡,研究内质网应激与凋亡之间的联系。结论:PCV2 Rep和Cap蛋白能激活PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路,PERK通路在Cap诱导的细胞凋亡中起重要作用。     

蓝莓花青素对RAW264.7细胞的抗炎活性研究及其机理初探（英文）

目的:以园蓝为研究材料,鉴定园蓝花青素提取物(GBBAEs)中的功能性成分的结构,建立脂多糖(LPS)诱导的体外炎症模型,并评价其抗炎作用和初步机制。创新点:首次探究了蓝莓花青素对建立的LPS诱导体外炎症模型的营养干预作用,并初步探究了发挥抗炎机制的作用通路。方法:将RAW 264.7细胞分为对照组(不作处理)和实验组(1μg/ml LPS刺激建模)。实验组进一步分为3个不同浓度组:400μg/ml GBBAEs组、800μg/ml GBBAEs组和1200μg/ml GBBAEs组。用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、干扰素γ(INF-γ)等炎症因子的释放量;用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)分析IL-1β、IL-6、TNF-α、环氧合酶-2(COX-2)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的炎症相关基因m RNA的表达水平;用蛋白质印迹法(Western blot法)测定相关炎症蛋白COX-2和NF-κBp65表达水平。结论:试验结果表明,通过ELISA法测定GBBAEs可以显著性抑制NO、PGE2、IL-1β、IL-6、INF-γ等炎症因子的释放;RT-PCR分析阐明在LPS诱导的单核-巨噬细胞RAW 264.7中,GBBAEs可以显著性抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2及MCP-1的炎症相关基因m RNA的表达水平。此外,Western blot法进一步显示GBBAEs对相关炎症蛋白COX-2和NF-κBp65表达具有明显抑制作用,进一步证实GBBAEs通过NF-κB机制通路来发挥抗炎作用。     

凡纳滨对虾铁蛋白基因的克隆与表达

以凡纳滨对虾为研究对象,通过RT-PCR技术扩增出铁蛋白（Ferritin）基因,经特定的酶切（Notl,Smal）后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌．经菌落PCR和质粒双酶切鉴定确认,证实成功地构建了对虾铁蛋白基因的原核表达载体．再对重组菌用IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose4B亲和层析得到目的蛋白用于制备抗体,为研究铁蛋白在对虾抗病毒免疫中的作用奠定基础．     

GST融合蛋白表达系统在实验教学中的应用

以GST-AQP7(Aquaporin 7)融合蛋白的原核表达为例,进行了生物学开放性实验教学的实践与探讨。利用PCR技术快速扩增小鼠AQP7-C末端亲水性肽段区基因片段,构建重组表达载体pGEX-4T-1∕AQP7,转化表达菌株E. coli BL21,诱导表达GST-AQP7融合蛋白,并对目的蛋白亲和层析纯化。PCR鉴定和DNA测序结果表明,pGEX-4T-1∕AQP7重组表达载体构建正确,SDS-PAGE蛋白电泳结果证实GST-AQP7高效表达并成功纯化。经过上述实验过程,学生系统掌握了从基因操作到蛋白表达一系列基本的分子生物学实验技能,很好地将课本所学理论知识应用于实验研究,提高了学生的综合科研素质,激发了学生的实验热情。