真核生物中分离目的基因的方法及研究进展

介绍了有关在真核生物中分离所要研究的目的基因的主要策略和进展，这些方法包括：物理方法、化学合成法、构建基因cDNA文库、基因扩增技术(PCR、NASBA)和计算机辅助技术等。     

细菌人工染色体基因组文库的构建及应用

细菌人工染色体(BAC)载体由于稳定复制、嵌合体少、分离纯化简单、转化效率高等优点,在构建基因组文库中得到了广泛的应用.BAC基因组文库构建的一般过程,主要有载体和高分子量DNA的制备、大片段DNA和载体的连接、重组载体转化受体感受态细胞、阳性克隆的挑取、文库质量的鉴定等.BAC基因组文库在基因克隆、基因组物理图谱的构建、基因组测序、比较基因组学的研究中有着十分广泛的应用.随着BAC载体的发展和更多生物BAC文库的构建,BAC基因组文库将会对基因组学研究产生重要的影响.     

日本七鳃鳗pcna基因克隆、生物信息学分析及真核表达

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),也称周期蛋白或DNA聚合酶的辅助蛋白,是真核细胞合成所必需的核蛋白,在DNA复制中起重要作用。前期实验发现日本七鳃鳗肝脏cDNA文库的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)中存在与高等脊椎动物pcna基因同源的序列。提取日本七鳃鳗(Lampetra japonica)肝脏组织RNA,通过RT-PCR方法扩增七鳃鳗pcna基因,对其进行生物信息学分析,并将Lj-pcna基因成功构建到pGFP-N2真核表达载体上,重组质粒PGFP-N2-Lj-pcna转染人Hela细胞,荧光显微镜下观察有荧光蛋白的表达。日本七鳃鳗pcna基因的真核表达载体成功构建和转染,为探讨七鳃鳗pcna基因功能研究及其它七鳃鳗相关研究提供条件。     

水稻小穗cDNA文库的构建

用蛋白酶K-苯酚法,从开花后7～14天的水稻小穗,抽提纯化出有生物学活性的总poly(A)~ RNA,在AMV逆转录酶作用下,将它反转录合成第一链cDNA,并在DNA聚合酶I和核酸酶SI作用下,合成双链cDNA。cDNA经甲基化修饰,通过EcoRI接头与表达型载体λgtll DNA连接,经离体包装构建出水稻开花后小穗cDNA文库。该文库的复杂度为2.4 ×10~6pfu,重组体的比率为14％。     

家蚕基因组“框架图”绘制完成

我国已在全世界率先完成家蚕基因组“框架图”绘制工作。这是我国科学家继完成人类基因组1%测序工作、水稻基因组“框架图”和“精细图”之后,向人类贡献的第三大基因组研究成果。这也是迄今为止我国科学家利用霰弹法测序完成的最大的生物种基因组,共注释获得了16948个完整基因,7285个基因片断。根据生物信息学的分析推断,家蚕约有两万个基因,其中约6000个基因为新发现。家蚕全基因组有4亿5千万个碱基对,约为人类全基因组的七分之一,略大于水稻基因组,但科研人员仅用了5个多月的时间就完成了从cDNA文库构建到测序和组装“框架图”的所有工…     

EST技术在植物基因克隆和基因表达谱研究中的应用

表达序列标签是cDNA的部分序列，是通过对cDNA库进行大规模上次性测序而获得．对于植物研究而言，该技术已成为一种高效、经济的克隆重要植物基因的工具．而且，通过分析来自特定组织的EST库可以定量地估计该组织中各类基因的表达丰度．这种组织基因表达谱可用于阐明植物的代谢调控网络或植物对生物、非生物胁迫反应的信号转导途径．章以几个典型的实例阐释如何利用EST技术来克隆重要的植物经济性状基因及以此技术进行表达谱研究．     

玉米大斑病菌 STK1基因 DNA 片段的分离和纯化

玉米大斑病是玉米生产上的重要病害,分离和纯化玉米大斑病菌 STK1基因对于研究其致病性具有重要意义.根据 STK1基因 cDNA 序列设计特异性引物,以玉米大斑病菌基因组 DNA 为模板扩增得到 STK1基因 DNA 片段.该基因片段的分离和纯化,为进一步获得 STK1的完整基因,进行基因结构分析和该基因的突变体构建奠定了良好的基础.     

抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析

抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)是一种高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得到了广泛的应用。本对SSH的技术原理、差减cDNA库构建的技术流程、常见问题分析及优缺点等作了较全面的介绍,可为研究们提供参考。     

禽腺病毒4型(FAdV-4)分离株对鸡的致病力及其基因组分析（英文）

目的:了解禽腺病毒4型(FAd V-4)分离株在口服、滴鼻点眼和肌注三种感染途径下对7～35日龄鸡的致病性,并分析该分离株与其他参考毒株在基因组水平上的差异。创新点:用原代鸡胚肾细胞(CEK)成功培养了FAd V-4分离株。发现除了常用的口服和肌注途径,FAd V-4也可通过滴鼻点眼接种途径感染7、21和35日龄鸡。肌注方法最为敏感,导致感染鸡100%死亡;35日龄鸡较7和21日龄鸡表现出更明显的临床症状和剖检病变。方法:通过口服、滴鼻点眼和肌注三种途径将FAd V-4分离株的CEK细胞培养物接种7～35日龄的无特定病原体(SPF)鸡。通过临床症状观察、排毒检测、病理解剖、免疫组化和组织中毒载量测定来判断分离株的致病性及病毒在组织脏器中的分布情况。通过病毒中和试验检测感染存活鸡的血清中和抗体。通过全基因组测序分析,比较FAd V-4分离株与国内外参考毒株的基因组序列差异。结论:本研究分离鉴定的FAd V-4分离株SD1511可以在CEK细胞上适应,并可以通过口服、滴鼻点眼和肌注三种感染途径引起7～35日龄的SPF鸡50%～100%的死亡,其中肌注最为敏感,死亡率达100%。感染鸡持续排毒至感染后的40天,产生具有明显中和作用的中和抗体。全基因组测序分析结果显示,SD1511基因组与最近国内分离的FAd V-4具有很高的同源性,但与国外的分离株有明显的差异。     

怪才文特尔与“文特尔速度”

今天，共有20个基因组被彻底解码，其中有10个是在文特尔博士的基因组研究所完成的。克雷格·文特尔的名字经常出现在基因工程与生物技术的许多文献中，而且人们说到他的时候，还都认为他有些“怪”。因此，我们在讲基因定序进程加速的时候，似乎有必要介绍一下基因研究怪才克雷格·文特尔以及他的“文特尔速度”。克雷格·文特尔博士，是世界上从事基因测序研究的主要专家之一，也是一位独来独往的百万富翁兼摇滚乐迷。在基因研究的过程中，世界上经常有克雷格·文特尔博士的声音和足迹。文特尔博士因成功研究快速测定人体基因的遗传密码的…     

Construction and characterization of a cDNA library from human liver tissue with chronic hepatitis B

INTRODUCTION Chronic hepatitis B virus (HBV) infection is aserious clinical problem because of its wide distribu-tion and possible adverse consequences, such as he-patic decompensation, cirrhosis and/or primary livercancer (PLC). The natural course of chronic HBVinfection is characterized by a series of hepatitic flaresor exacerbations and remissions (Ganem and Prince,2004). The severity, extent, duration and frequency ofhepatic histopathological changes in hepatitic flaresare d…     

水稻幼苗SAGE文库的构建和测序

基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)是功能基因组学研究中的一项功能强大的工具.对水稻幼苗SAGE文库的构建进行了探索试验,其主要操作步骤为:以磁珠法提取PolyA mRNA用于合成双链cDNA,再经过一系列的酶切、加接头序列、连接、PCR扩增,获得到26-bp的水稻双标签体,再将26-bp Ditag连接成标签链接体,并将其克隆进pZero-1载体中用于测序.DNA测序结果证明获得了水稻的SAGE标签.试验的各个中间步骤的结果均经过PCR验证.yh     

西文蜜蜂LOC724521基因座的cDNA序列克隆及TSS的分析

5’LongSAGE标签得自于全长mRNA分子的5’末端的前19 nt.该研究利用定位在西方蜜蜂基因组中的一个预测基因座LOC724521的2条5’LongSAGE标签序列作为5’引物,通过RT-PCR克隆了该预测基因座的2条长335 bp和337 bp的cDNA序列（GenBank登录号：GU358205,GU358204）.此cDNA编码一条长88个氨基酸残基的多肽.用所克隆的cDNA序列对基因座LOC724521进行功能注释发现,该基因含有3个外显子和2个＂GT-AG＂型内含子.5’LongSAGE标签序列的基因组定位结果显示：基因座LOC724521在雄蜂的头部中表达丰度很高,RNA PolⅡ可从5个转录起始位点（TSS）上以不同效率起始转录,该基因的59%和31%的转录是从2个优势TSS上起始.有趣的是,有一条5’LongSAGE标签序列被定位在内含子区,暗示该基因存在外显子的可变性选择现象.该研究结果不仅在转录水平上证实了软件预测的基因座LOC724521确实存在,同时揭示了该基因存在可变性转录起始位点和可变性外显子选择等转录调控机制.     

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)查尔酮合成酶基因OvCHS的克隆与序列分析

根据GenBank发布的基因序列,设计PCR引物,分别从诸葛菜(Orychophragmus violaceus)的花瓣基因组DNA和cDNA克隆到查尔酮合成酶基因,并定名为OvCHS,序列已上传至NCBI数据库,登陆号为EF408918。序列分析表明,OvCHS基因的基因组全长为1263 bp,具一个75 bp的内含子,编码区全长为1188 bp,编码395个氨基酸。与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)查尔酮合成酶基因AtCHS比较发现,两基因编码区有135个碱基不同,相似性为88.64%,氨基酸序列中仅16个氨基酸残基的差异,相似性达95.95%。     

七鳃鳗含硒谷胱甘肽过氧化物酶2的分子克隆、生物学特性及表达分析

谷胱甘肽过氧化酶2(GPx2),是生物体内重要的一类抗氧化酶,能够通过酶解过氧化氢阻断活性氧(ROS)的有害作用。本研究从七鳃鳗的血液c DNA文库中克隆了GPx2 c DNA全长和基因组DNA序列。序列分析表明,其c DNA全长为868 bp(Gen Bank序列号KM211710),包括53bp 5′非编码区、251bp 3′非编码区和564 bp开放阅读框,编码由187个氨基酸组成的多肽。基因组DNA序列(Gen Bank序列号KM211711)揭示了基因组特征含有2个外显子和1个内含子结构。系统发育分析表明,七鳃鳗GPx2(Lj GPx2)与其它的GPx2具有很高的同源性。利用实时荧光定量PCR检测到GPx2基因在七鳃鳗各组织中广泛表达,其中在口腔腺、心脏、卵、生殖腺中表达量较高。此外,用脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后发现,Lj GPx2 m RNA在生殖腺中表达量显著升高。本研究为探讨GPx2在七鳃鳗的免疫应答中的作用提供了理论依据。     

果蝇血液发育标记基因Dox-A3多克隆抗体的制备

从野生型成体果蝇体内提取总RNA,以cDNA作为模板进行PCR扩增,获取Dox-A3部分基因片段,将这片段连接于原核表达载体pET-28a上,成功构建重组质粒pET-28a-Dox-A3.将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,用ITPG诱导表达出融合蛋白,然后将经Ni-IDA凝胶柱纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备Dox-A3多克隆抗体,通过Western-Blot检测效价和特异性.结果表明,实验获得了高质量的多克隆抗体.     

CHARACTERIZATION AND RNA2 NUCLEOTIDE SEQUENCE OF BROAD BEAN WILT VIRUS 2 ISOLATE P158

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＢｒｏａｄｂｅａｎｗｉｌｔｖｉｒｕｓ (ＢＢＷＶ)ｉｓｔｈｅｔｙｐｅｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＦａｂａｖｉｒｕｓ.Ｉｔｈａｓａｗｉｄｅｈｏｓｔｒａｎｇｅａｍｏｎｇｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓａｎｄｓｏｍｅｆａｍｉｌｉｅｓｏｆｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ,ａｎｄｉｓａｎｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｌｙｉｍ ｐｏｒｔａｎｔｖｉｒｕｓｉｎＣｈｉｎａ (Ｚｈｏｕｅｔａｌ.,1 994 ) .ＢＢＷＶｈａｓｉｓｏｍｅｔｒｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓ,ｈｅｘａｇｏｎａｌｉｎｏｕｔ ｌｉｎｅａｎｄ 3 0ｎｍｉｎｄｉａｍ…     

Representative appressorium stage cDNA library of Magnaporthe grisea

A mature appressorium cDNA library of rice blast fungus, Magnaporthe grisea, was constructed in a λTriplEx2 vector by SMART?cDNA library containing 2.37×106 independent clones about 100% of which harbor foreign cDNA inserts with average size of 660 bp. Of 9 randomly