毕赤酵母直接基因敲除方法的研究

甲醇营养型巴斯德毕赤酵母已被广泛应用于外源蛋白的表达,但是作为一个外源蛋白表达系统,其还有待进一步完善。进一步提高外源蛋白的表达量以及形成折叠正确的目的蛋白,成为了改造毕赤酵母菌株的一个热点。基因缺失,是一个常用的改造和构建新的毕赤酵母重组菌株常用的方法。巴斯德毕赤酵母直接基因缺失方法主要分为两类:有标记的插入替换和无标记的Pop-In/Pop-Out。本文系统地介绍了这两种方法,分别比较了各自的优缺点,为它们在巴斯德毕赤酵母中进行基因敲除提供了一定参考意义。     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是应用较为成功的外源蛋白表达系统之一,它具有真核生物表达系统的特点,能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工,至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达.本文综述了毕赤酵母表达系统的一些特点和优势、毕赤酵母表达载体组成和外源蛋白在毕赤酵母中表达的过程.     

蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达

将蚓激酶基因克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达裁体pPICgk-lum3.将其线性化后转化毕赤酵母GS115,挑选Muts型毕赤酵每转化子,经甲醇诱导表达,纤维平板法检测其上清液纤溶酶活性最大为80U/mL.     

内切纤维素酶EGII基因克隆及其在毕赤酵母中高密度发酵表达

该文利用RT-PCR方法从里氏木霉mRNA获得EGII cDNA,插入酵母表达载体pPIC9K,整合到毕赤酵母染色体上,获得重组酵母菌株GS115-EGII,通过高密度发酵条件下甲醇诱导,使EGII基因在毕赤酵母中得到了高效表达。     

重组毕赤酵母培养基碳源的选择

目的：对毕赤酵母重组菌GS115-Ch—Glu菌种进行发酵脱毒条件的优化,为大规模发酵重组毕赤酵母获得高表达目的蛋白奠定基础。方法：以毕赤酵母重组菌为实验菌株,分别以葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、蛋白胨、甘油、玉米淀粉＋甘油为碳源,研究不同碳源对菌株细胞生长的影响。结果：毕赤酵母重组菌的最适碳源为玉米淀粉,最适浓度为2．5％。     

拟穴青蟹抗菌肽scygonadin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

采用PCR方法克隆获得拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因成熟肽片段,将其连接到Pichia pastoris酵母表达载体pPIC9K中,构建了分泌表达载体pPICgk-Scy．电击转化毕赤酵母GS115,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合人酵母基因组中．以甲醇诱导表达阳性克隆,上清中表达产物经过Tricine-SDS-PAGE鉴定与预期的目的蛋白大小（约10ku）相符．并利用琼脂孔穴扩散法证明了表达产物能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长．     

应用人延伸因子1α亚基启动子和人工转录激活因子提高外源基因在CHO细胞中的表达

来大志、翁少洁、于长明、齐连权、付玲、于婷、陈薇在《生物化学与生物物理进展》2004年第2期撰文指出:表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要.而表达载体中最为重要的元件是启动子,一些常用病毒来源的启动子,如巨细胞病毒即早期启动子(PCMV-IE)仅在S期激活,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖,这对于连续持久大规模培养的宿主细胞不现实.而人延伸因子1α亚基启动子(PEF-1α)不受细胞周期限制,且启动子强度高于PCMV-IE,对于大规模外源蛋白的生产较为理想.首先构建了基于PEF-1α启动子的哺乳动物细胞表达载体pED5,在增     

杆状病毒后期启动子在大肠杆菌中启动CAT基因表达的研究

以CAT基因为报道基因,探讨了杆状病毒后期启动子在大肠杆菌中启动表达CAT基因的活性。结果显示在不含多角体基因及其启动子的质粒中,具合成启动子的表达量最高,野生型多角体启动子的表达量次之,而含ⅩⅣ多角体启动子的最低;具相同CAT基因启动子的质粒中,含多角体蛋白基因及其野生型启动子者较不含者强,含合成与ⅩⅣ启动子串联组合者与单纯ⅩⅣ启动子者表达量近乎一致,但均较前者为弱。以上结果表明,杆状病毒后期启动子在大肠杆菌与在昆虫细胞中的启动表达的能力并非完全一致。     

大豆降解组文库microRNAs的启动子分析(英文)

研究目的:通过分析miRNA的核心启动子和顺式作用元件为进一步解析大豆(Glycine max)miRNAs表达调控及其功能研究提供重要信息。创新要点:利用生物信息学方法全面解析了大豆降解组文库miRNA的启动子特征,并依据顺式作用元件及靶基因构建了miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之间存在潜在的负反馈调控网络。研究方法:本研究利用TSSP程序和PlantCARE数据库预测了来自大豆降解组文库的440个miRNA的核心启动子以及369个miRNAs的顺式作用元件,并依据顺式作用元件及靶基因构建miRNA调控网络。重要结论:83.86%的miRNA在其上游序列中含有启动子,8.64%的miRNA在其下游序列中含有启动子,21.59%的miRNA包含增强子。核心启动子的TATA盒与转录起始位点(TSSs)的分布相似。此外,对转录起始位点5'端的顺式作用元件预测为miRNAs的可能功能和表达的时空性提供了线索。miRNAs的顺式作用元件和靶基因的分析显示,部分miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之间存在潜在的负反馈调控。     

毕赤酵母发酵过程胞内活性氧的定量分析

利用流式细胞术对毕赤酵母发酵过程中胞内活性氧（ROS）的变化进行定量检测和分析,建立发酵过程单位细胞胞内ROS的相对含量以及单位体积细胞胞内ROS相对含量的计算方法,分析ROS积累对毕赤酵母细胞活力的影响,研究结果表明：在甲醇流加阶段,单位细胞的DCF（2′,7′-二氯荧光黄）染色平均荧光强度随着时间的增加而增加,即单位细胞胞内ROS的含量在甲醇流加阶段一直增加,细胞内产生持续的氧化压力,导致部分细胞死亡;单位体积酵母细胞的胞内ROS含量在甲醇流加阶段保持在一个相对稳定的范围。