小鼠超高硫角蛋白基因启动子的分子克隆及序列分析

根据小鼠超高硫角蛋白（UHS）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以小鼠全血提取的总DNA为模板,PCR扩增出688bp的特异性片段,连接到pMD19T载体中获得该片段克隆p19TU。经过快速提取质粒法筛选、限制性内切酶分析证明该克隆就是UHS基因5’端的调控区序列。序列分析结果也表明该克隆片段与原基因调控序列相比具有很高的一致性。研究结果为今后制备转基因克隆动物、在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础。     

一株嗜热梭菌β-葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取嗜热梭菌(Clostridium.sp)基因组DNA,首次通过PCR克隆了该菌的β-葡聚糖酶基因全长,结果表明:该基因全长1040bp,ORF为1003bp,编码334个氨基酸,计算分子量为37.8kD,等电点为7.67。经Blast分析,该序列与热纤梭菌同源性最高(99%),而与基因库中嗜热梭菌的同源性为94%,该基因已被GenBank接受(AY225318)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET鄄30a( )后相连接,构建重组表达载体pET鄄clo,并导入BL21细菌中表达.酶学特性表明:SDS鄄PAGE电泳在37kD左右有表达蛋白带,该工程菌最适酶活29.4U/mL,是出发菌的15倍,最适温度在80℃左右,最适pH在9左右。该工程菌可构建耐热性好、酶活高的杂合基因工程菌。     

鸡白细胞介素18全长基因的克隆、表达及分子进化分析

根据鸡白细胞介素18（IL-18）cDNA基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术,从脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激的我国地方品种萧山鸡原代鸡脾细胞中扩增并克隆鸡IL-18全长基因（Genbank accession,AY628648）。扩增片段全长591bp,共编码197个氨基酸的前体蛋白,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡IL-18全长基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性为98．99％。只在引导序列中出现两个氨基酸残基的缺失,分子进化分析表明萧山鸡IL-18基因与火鸡以及家鸭基因形成一个独立的分支。将萧山鸡IL-18成熟蛋白序列插入pGEX-4T-2载体并在Ecoli中得到表达,获得45kD的GST-IL-18融合蛋白。经纯化后用于制备多克隆抗体。本研究对萧山鸡白细胞介素18的全长基因进行了克隆及表达,并对其分子进化进行了分析。为深入研究其功能奠定了基础。     

大豆全长cDNA分析

由于大豆种子具有高油高蛋白,且可与土壤微生物共生进行生物固氮的特性,大豆已成为最重要的农作物品种之一。大规模的收集全长c DNA对于基因组序列的准确注释和基因及其产物的功能分析是十分必要的。我们用不同发育阶段和环境条件下的大豆构建了全长c DNA文库,并从中获得了总共39,936个大豆c DNA克隆。分别从每个克隆的5’端和3’端进行测序后,共得到68,661个表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)。这些EST序列被聚类成包含2580个全长序列的22674个长片段。此外,我们对4712个全长c DNA进行了测序。去除重叠后,我们目前共得到6570条新的大豆c DNA序列。我们的数据表明87.7%的大豆c DNA克隆包含除5’-UTR和3’-UTR的完整编码区序列。已有数据证明我们测得的全长c DNA覆盖了大量不同种类的基因。通过将大豆序列与拟南芥、水稻和其他豆科植物数据进行对比分析后发现,我们的结果中包含一些特异基因,并且其中很大一部分经注释后发现存在未知功能。本研究报道的这组大豆全长c DNA克隆,将为大豆基因发掘提供有用的资源,并有助于大豆基因组的精确注释。     

青稞脂质转运基因LTP19的克隆与表达

植物脂质转运蛋白(Lipid Transfer Protein,LTP)是一类含量丰富并且由多基因家族编码的小分子碱性蛋白。本研究根据NCBI数据库中大麦LTP19的预测信息设计引物,以大麦品种Morex为参照,克隆青稞肚里黄的LTP19基因编码区域,对其核酸及蛋白序列进行生物信息学分析,并通过RT-PCR方法分析了青稞LTP19的组织表达情况。结果表明:青稞LTP19 c DNA片段长度为376 bp,与大麦LTP19基因同源性为99%;生物信息学分析表明青稞LTP19具有脂质转运蛋白家族共有特性,具有N端信号肽结构;半定量RT-PCR检测结果表明,LTP19在肚里黄各器官中表达趋势与Morex相似,茎和叶中表达量较高。     

极大螺旋藻(Spirulina maxima)藻蓝蛋白基因的克隆及其同源性分析

藻蓝蛋白是红藻和蓝绿藻中一种重要的捕光色素蛋白．克隆了编码极大螺旋藻藻蓝蛋白α和β两个亚基的基因，序列分析表明该基因全长为1119bp．β亚基基因位于α亚基基因上游，两个亚基基因序列长度分别为519bp和489bp，中间被111bp的基因片段间隔．除编码α和β两个亚基的开放阅读密码框外，还存在两个潜在的开放阅读密码框，但这两个密码框的意义还不清楚．比较了该藻蓝蛋白氨基酸序列和来自于其他藻类的藻蓝蛋白氨基酸序列的同源性以及藻蓝蛋白α和β两个亚基之间氨基酸序列的同源性，总的来说其同源性在45．9％．99％之间，α和β两个亚基氨基酸序列同源性为27．1％．藻蓝蛋白包含许多疏水性氨基酸，这些疏水性氨基酸在藻胆蛋白的聚集过程中起着极为重要的作用．分析表明编码藻蓝蛋白α和β两个亚基基因的密码子显示出非对称性．     

Aspergillus niger FS6中β—1,3—1,4—葡聚糖酶cDNA片段的克隆及序列测定

通过RT－PCR方法首次从真菌Aspergillus niger FS6 中扩增和克隆到β-1,3-1,4-葡聚糖酶cDNA片段。序列测定表明：该片段全长280bp.经Clustal W软件进行同源性分析后表明，该序列与枯草芽孢杆菌、水解淀粉芽孢杆菌、厌氧真菌、牛链球菌和热纤维梭菌中β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因同源性很高，分别为91％，90％，70％，67％，65％。     

顺乌头酸酶AtACO3参与调控Zn稳态的研究

从拟南芥中克隆得到AtACO3基因的全长cDNA序列.半定量PCR实验结果表明,200 μmol/L CuCl2处理能明显抑制该基因的表达,而200 μmol/L ZnCl2处理1h则可显著促进其表达.为验证AtACO3蛋白N端的功能,构建AtACO3 5端1632 bp基因片段的原核表达载体pET30a-AtACO3-N,并转化大肠杆菌.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,该基因片段可以在大肠杆菌中稳定表达.进一步的抗性实验表明,异源表达基因AtACO3的N端序列能提高大肠杆菌的Zn2+耐受性.     

Zn/Cd超富集植物天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)中TcCaM2基因的克隆及在酵母中的重金属耐受性分析

从重金属超富集植物天蓝遏蓝菜(T. caerulescens)Cd胁迫的cDNA文库中，通过基因表达的差异筛选得到的阳性克隆之一，核苷酸序列分析表明与拟南芥CaM2的相似性高达92%，故命名为TcCaM2(T. caerulescens CaM2, GenBank No. EF053035)。其核苷酸序列与迄今已知的钙调蛋白基因同源率在83%以上，其氨基酸序列同源性高达95%以上，与大多数高等植物的CaM，如印度芥菜、拟南芥、水稻等同源性则更高。将TcCaM2基因置于酵母表达启动子之下，构建酵母表达载体，并将其转入重金属敏感型酵母突变菌株，酵母重金属耐受实验表明，TcCaM2在酵母中的过量表达提高了酵母对Co2+或Ni2+的耐受性，增加了对Cd2+的敏感性，对Zn2+胁迫抗性稍有增加但差异不显著；说明TcCaM2通过其对重金属离子的结合作用及在信号转导系统中的功能，在植物细胞对重金属的富集、耐性中发挥了重要的调节作用。     

自然科学总论

蝴蝶兰花发育相关基因pPI9的克隆与表达分析CloningandExpressionAnalysisofaPhalaenopsisFlowering-relatedgenepPI9郭滨陈东红戴薇魏星明凤摘要:为研究具有复杂而特异花型的蝴蝶兰花发育的分子机制,利用RT-PCR方法从蝴蝶兰花瓣总RNA中分离出834bp长的cDNA片断.序列分析表明,该cDNA片断与拟南芥的PI基因有60%的同源性,命名为pPI9.它包含一个开放阅读框,具有编码24.5ku蛋白质的能力.推导的氨基酸序列中,N端包含一个完整的MADS盒,C端有明显的PI基序.半定量PCR结果表明该基因只在植株的生殖器官中表达,而在营养器官中不表达,…     

人纤维蛋白原α、β、γ基因的克隆和表达研究

纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)是凝血因子I,在体内经凝血酶(thrombin)作用下转变为纤维蛋白,发挥其凝血和止血功能。本研究通过反转录的方法,从杭州人肝脏中成功克隆到人纤维蛋白原α、β、γ基因,并将其定向插入原核表达载体中,人纤维蛋白原α、β、γ基因经成功诱导获得表达,进一步纯化获得人纤维蛋白原α、β、γ蛋白。序列经比对,与Genbank上公布的序列同源性达97%～99%,这项研究为我国汉族人群纤维蛋白原基因核苷酸多态性和单倍型研究发挥一定作用,并且对纤维蛋白封闭剂的开发,提供了重要的产业化实验依据和技术基础。     

一个新型湖羊瘤胃木聚糖酶基因的克隆和鉴定

构建了一个湖羊瘤胃未培养微生物的Fosmid宏基因组文库,获得了12,000个克隆,文库外源DNA总容量为3.6×108 bp,筛选得到2个表达内切-1,4-β-木聚糖酶活性的克隆,并对其中的一个克隆UMXYL2进行亚克隆。结果表明存在一个完整的全长为1086 bp的ORF,编码一个可能的内切-1,4-β-木聚糖酶基因UMXYL2-1-1(accession No.FJ814702)。Blastp分析得知UMXYL2-1-1的编码产物与产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogenes(accession No.AAA21848.1)的内切-1,4-β-木聚糖酶同源性最高,氨基酸序列相似性为67%,属于糖基水解酶家族11的成员。遗传进化分析表明UMXYL2-1-1基因可能是来自湖羊瘤胃微生物丝状杆菌属一个未培养的种。     

浙贝母DNA条形码技术研究

DNA条形码技术是一种新型的生物身份识别系统,能够利用鉴别物种内的一段标准的、具有足够变异性、并相对较短且易扩增的DNA片段对生物物种实现快速的自动鉴定。本研究首先采用试剂盒提取法从17个贝母种79个样品中提取了基因组DNA,并进行了纯度与浓度鉴定;然后采用ITS1、ITS2序列引物进行PCR扩增和产物测序,最后进行序列比对,以明确DNA条形码序列ITS1和ITS2在浙贝母种质资源中的鉴定效果。结果发现,浙贝母地方种间的ITS序列差异不大,ITS序列对浙贝母种内分辨率过于低下。由此表明DNA条形码ITS1、ITS2序列并不太适合用作浙贝母的DNA条形码技术。     

SV40早期启动子中原核增强子样序列的初步研究

萤火虫荧光素酶基因cDNA真核表达载体pGL2可在原核细胞中高效表达。该载体中含有SV40早期启动子及荧光素酶基因cDNA5'端总长共758bp的DNA碱基序列，经计算机分析发现，在SV40早期启动子中含有SV40基因组HindⅢB片断中一段长为49bp的DNA序列，且荧光素酶基因cDNA编码区的5'端含有一个原核细胞基因表达调控区相似序列。将pGL2中的荧光素酶基因cDNA（Luc）克隆入真核表达载体pED中，构建成pED-Luc。该载体经表达测定后，只在真核细胞中表达，在原核细胞不中表达。这说明荧光素酶基因cDNA编码区的5'端的原核细胞基因表达调控区相似序列不具表达有活性的荧光 素酶的功能。经DNA序列对比研究，认为pGL2含有的SV40基因组Hind ⅢB片段5123bp-5171bp长49bp的DNA序列可能就是Hind ⅢB片段的原核增强子功能的决定序列。     

浙江沿海一新纽虫的18S rDNA序列研究

为进一步确定浙江沿海发现的一新纽虫的分类地位,本文根据GenBank中已报道的纽虫18SrDNA保守序列设计引物,通过PCR扩增,获得该纽虫的18SrDNA部分序列,对该纽虫的18SrRNA基因进行了克隆和序列分析。并将该纽虫18SrDNA基因的序列与NCBI数据库中已收纽虫的18SrDNA基因进行了比较,分析该纽虫与其他纽虫的同源性。利用系统进化树和形态学的研究结果确定其分类地位。结果表明,该纽虫属于异纽目（Heteronemertea）纵沟虫科（Lineidae）动物。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒日本株(C3)ie0基因的序列分析和表达

从斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）日本株（C3）基因组中克隆了ie0基因。核苷酸序列分析表明,该克隆片断涵盖了864 bp的读码框及5′端启动子区475 bp和3′端终止区90 bp的序列。氨基酸序列分析显示,在SpltMNPV IE0蛋白N-端23～47位以及111～126位富含酸性氨基酸和疏水性氨基酸残基,C′端第225～271位具有典型的CX2CX14CCX4CX2CX15CX2C双锌指基序,该结构在所比较的9个昆虫杆状病毒IE0蛋白中是十分保守的。联配分析表明,SpltMNPV日本株（C3）的核苷酸序列和氨基酸序列与其他9种核多角体病毒的同源性有较大差异。以ie0基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒（Bombyx mori Nu-cleopolyhedrovirus,BmNPV）与苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multicapcid nucle-opolyhedrovirus,AcMNPV）归到同一分枝,这与以p10、gp37和egt基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树结果一致。并进行了大肠杆菌表达和Western Blotting分析。     

10项引领未来的得意洋洋技术(一) 基因修饰技术

基因修饰主要是指利用生物化学方法修改DNA序列,将目的基因片段导入宿主细胞内,或者将特定基因片段从基因组中删除,从而达到改变宿主细胞基因型或者使得原有基因型得     

深海王祖农菌酯酶基因克隆及表达

酯酶被应用在很多方面,但是能够满足工业需要的天然酯酶却很少。利用PCR技术从Zunongwangia profunda克隆出了酯酶基因estA。基因estA含有一段1272 bp的ORF,序列分析发现与Anaerophaga thermohalophila的酯酶家族基因同源性为60%。利用表达菌株E.coli BL21(DE3),pGEX-6p-1质粒构建表达载体,并对其进行蛋白表达并纯化回收得到EstA,以便后续酶学性质及应用价值探究。     

杭州地区一株侵染水稻的嗜水小核菌菌株的鉴定

从杭州地区有纹枯病症状的水稻植株上采集分离到一株编号为HZ11的病原真菌菌丝形态与水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）相似,但其菌核形态与丝核菌属真菌有明显差异。由此对该菌株进行了形态学、18S rDNA和ITS序列分析的鉴定。ITS序列分析表明该菌株与嗜水小核菌（Sclerotium hy-drophilure Sacc）有99%的同源性,18S rDNA序列则与许多丝核菌属（Rhizoctonia）序列最大同源性达99%。根据综合分析,推断菌株HZ11为嗜水小核菌（S. hydrophilure）,并建议将嗜水小核菌归属于丝核菌属。这是第一次报道侵染水稻的嗜水小核菌并向NCBI提供了第一条该菌的18S rDNA序列。     

FDA首次批准由转基因动物生产药物上市

美国食品药品管理局（FDA）首次批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn上市。这种新药的推出．有望拉开用活的转基因动物器官作为药物工厂的序幕．未来几年类似药物将会相继上市。Atryn由设在马萨诸塞州的GTC生物制药公司研发生产,通过对山羊进行基因改造后,山羊奶中就会产生丰富的抗凝血酶,这种蛋白在人体内可以作为天然的血液稀释剂,用于治疗遗传性抗凝血酶缺乏症。为了制造这种蛋白．GTC公司从人的基因中提取了抗凝血酶,将其同山羊的DNA结合在一起（通常情况下,该DNA控制羊奶中蛋白的生产．以确保该抗凝血酶仅仅在羊奶中产生）。