酿酒酵母转化方法的新探索

在现有电转化和聚乙二醇/醋酸锂(PEG/LiAc)诱导的化学转化的基础上,进一步研究和探索了酿酒酵母感受态细胞不同预处理及相应的转化条件对转化效率的影响。结果表明:处于对数生长早期(OD600=0.6)的酵母细胞的转化效果最佳;电转化中分别以120 mmol/L的DTT和300 mmol/L的LiAc预处理感受态酵母菌10 min,可以得到较高的转化效果;联合使用120 mmol/L DTT和300 mmol/L LiAc能大幅提升酵母转化效率,达到7.15×105cfu/μg,PEG/LiAc诱导的化学转化中使用300 mmol/L LiAc能大幅提升酵母转化效率,达到2.75×105cfu/μg,远高于文献报道的水平。同时证明了改进后的转化方法同样能够提高外源DNA同源重组转化效率。     

细菌的自然遗传转化及其意义与思考

自然遗传转化是细菌遗传信息横向传递并促进进化的重要方式。自然环境中具备细菌进行转化的条件,有转化活性的DNA和感受态的细菌细胞,使细菌能够进行转化。人们应该客观地评价使用遗传工程微生物（genetically engineered microorghisms简称GEMs）所产生的经济效益与风险,并重视生物安全问题。     

4℃存放对感受态细胞转化频率的影响

感受态细胞的制备是基因工程中转化技术的关键。为获得所需的工程菌,往往需进行多次转化工作。因此,实际操作中,总是愈简便愈好。宿主菌划线平皿在4℃冰箱存放有效时限是一个月.感受态细胞4℃冰箱存放有效时限为三天。在有效时限内.感受态细胞转化频率虽有所下降,但仍能满足转化需要。充分利用有效时限,能使转化工作简便、快捷、并节省人力、物力。     

拟南芥总RNA的提取及RT-PCR扩增CBF1基因

CBF1基因的扩增是研究植物抗旱基因的前期工作。本研究用Trizol试剂法提取模式植物拟南芥叶片的总RNA,经过反转录进行PCR扩增,将产物DNA回收后,连接PCR片段与T载体,电击转化入E.coli大肠杆菌感受态细胞;涂平板长出菌落,挑取半个白斑菌落电泳鉴定转化子;鉴定完成后提取质粒,用双酶切法进行鉴定,结果表明获得CBF1基因。     

脱硫菌16S rDNA片段的克隆与序列分析

生物脱硫技术在能源工业发展和环境保护等方面显示出潜在的优势。本文利用NaAc法抽取总DNA作模板，用真细菌专一性引物进行PCR方法扩增HB2的16S rDNA片段并进行琼脂糖凝胶的回收，选用PUCm—T—vector，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，然后在含氨卞青霉素Ap／IPTG／X2gal的平板上筛选阳性克隆，PCR检测阳性克隆最后进行测序。结果表明，所测片段序列与多种假单胞杆菌的16S rDNA的同源性达98％以上。     

细菌人工染色体基因组文库的构建及应用

细菌人工染色体(BAC)载体由于稳定复制、嵌合体少、分离纯化简单、转化效率高等优点,在构建基因组文库中得到了广泛的应用.BAC基因组文库构建的一般过程,主要有载体和高分子量DNA的制备、大片段DNA和载体的连接、重组载体转化受体感受态细胞、阳性克隆的挑取、文库质量的鉴定等.BAC基因组文库在基因克隆、基因组物理图谱的构建、基因组测序、比较基因组学的研究中有着十分广泛的应用.随着BAC载体的发展和更多生物BAC文库的构建,BAC基因组文库将会对基因组学研究产生重要的影响.     

拟南芥热激蛋白HSP70基因片段克隆实验体系的建立

以拟南芥为材料,对热激蛋白HSP70基因片段进行了克隆研究,获得了最佳的分子克隆实验体系．首先提取拟南芥总DNA,接着在热激蛋白HSP70编码区设计引物,扩增出HSP70编码区的片断,再将HSP70编码区的片断加上具有EcoRⅠ酶切位点双链的人工接头,通过EcoRⅠ对其进行酶切．再与经过EcoRⅠ酶切并已经去磷酸化的PUC19载体通过T4连接酶进行连接,然后将连接产物置人到感受态大肠杆菌细胞中（即转化）,并让这种细胞在含有Amp＋／IPTG／X—Gal的LB培养基上生长．挑取培养基上蓝白斑中的白斑,进行质粒DNA提取,通过酶切质粒DNA,从而初步判断目的片段已被克隆．     

日本对虾β-actin基因的克隆表达与纯化

利用RT-PCR技术从日本对虾中克隆到β-actin基因的cDNA,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得阳性克隆.4℃下IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得高纯度的β-actin蛋白.①     

人铁蛋白基因的克隆与原核表达

通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体．     

一种嵌合式DNA聚合酶的表达及功能验证

为了建立一套基于大肠杆菌表达系统的嵌合式高保真DNA聚合酶的重组表达与纯化的工艺,首先将含有目的基因的质粒转化至大肠杆菌BL21中,通过高压破碎仪进行细胞破碎,再用离子交换层析方法获得嵌合型高保真聚合酶。优化反应条件显示在28℃自动诱导下表达的嵌合DNA聚合酶蛋白产量较高。利用高压破碎仪将细胞破碎获得可溶蛋白,然后利用硫酸铵沉淀将蛋白粗纯,并采用离子交换层析柱纯化,最终获得较纯的DNA聚合酶。通过对获得的嵌合DNA聚合酶进行活性分析,证实该聚合酶具有高效的活性,为以后大规模生产高保真DNA聚合酶奠定基础。     

肝素酶的原核表达与表达条件优化

利用PCR技术从肝素黄杆菌克隆到肝素酶HepI基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliBL21感受态细胞,获得基因工程重组菌．12℃下IPTG诱导表达12h,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得较高纯度的HepI酶蛋白．     

植物遗传转化技术研究概况

本文介绍了植物基因转移的各种方法，涉及载体介导的转化、DNA直接转化和种质系统转化．     

人Rab7基因的原核表达与多克隆抗体制备

利用RT—PCR技术从HEK293细胞中克隆到人Rab7基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliDH5α感受态细胞,获得阳性克隆．24℃下IPTG诱导表达,Glutathi—one Sepharose 4B纯化后获得高纯度的Rab7蛋白．并以此为抗原免疫小白鼠,获得了Rab7的特异性抗体．     

细菌转化的机制

<正> 新版高中生物教材必修本介绍了“肺炎双球菌的转化”实验,但是没有涉及到转化的机制。转化是指用甲种细菌处理乙种细菌,使乙种细菌具有甲种细菌的某些遗传特性。细菌转化具有一定的普遍性,是生物界进行遗传物质交流的一种方式。那么,转化是怎样进行的呢?研究证明,细菌转化的机制包括吸附、吸收和DNA重组3个阶段。首先,供体菌的双链DNA被吸附在受体菌细胞表面的     

“转化”的定义与“影印法”——对2016年高考全国理综乙卷第40题的探讨

<正>1试题某一质粒载体如图1所示,外源DNA插入到Amp~r或Tet~r中会导致相应的基因失活(Amp~r表示氨苄青霉素抗性基因,Tet~r表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有3种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下     

肺炎双球菌的转化实验涉及的4个问题

<正> 问题1 S 型肺炎双球菌的 DNA 经过高温为什么不会失去活性?有荚膜、致病的 S 型肺炎双球菌的 DNA 可以进入无荚膜、非致病的 R 型肺炎双球菌,使 R 型肺炎双球菌的表型和性状均发生改变,如无荚膜表型转换为有荚膜表型,同时其非致病性状转化为可致病性状。转化的实质是s型肺炎双球菌的部分 DNA 片断进入并整合进 R 型肺炎双球菌的基因组。60℃～100℃的高温可杀死 S 型肺炎双球菌细胞,一小部     

枯草芽胞杆菌基因文库的构建

以λEMBL3为载体,以大肠杆菌Q358及Q359为宿主成功地构建了枯草芽胞杆菌808的基因文库。采用Marmur的方法从供体菌中提取大于50Kb的染色体DNA,酶切后用5～25％NaCl梯度离心,分部收集15～20Kb的DNA片段作为供体,从甘油梯度纯化的噬菌体提取λEMBL3 DNA经BamHI,EcoRI双酶解,退火处理,纯化得左、右臂作为载体,供体与载体DNA以1:2浓度进行连接反应,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统制备的包装抽提物进行体外包装,感染大肠杆菌Q358及Q359,测定重组噬菌体数目,实验结果表明:重组体滴定达7.5×10~4pfu/μgDNA,超过Clarke和Carbon公式的理论值的要求,并从该文库中钓出淀粉酶基因,证明所建文库是有效的。     

根癌农杆菌介导植物遗传转化的分子机制

根癌农杆菌介导转化法是目前应用最广泛的植物转基因方法,通过植物表达载体上DNA的加工和转移将外源DNA转运到植物细胞内.主要介绍了根癌农杆菌介导植物遗传转化的分子机制.     

大肠杆菌感受态制备与转化实验

大肠杆菌的制备与转化实验是各高校生物院系开设的基础实验,也是本科生所应熟练掌握的基本实验,但在具体实施过程中,由于实验学生理解不深入,操作技巧不足,指导老师讲授时间有限,实验准备不到位等原因,最终致使实验成功率并不理想.针对教师实验准备、学生实验理解及操作等各个方面给予充分详细的解释与说明.     

蚕微卫星DNA的体外自我扩增条件初步研究

采用一种类似PCR的基因组自我引发PCR(GSP—PCR)法，初步研究了家蚕、野蚕、天蚕、蓖麻蚕和柞蚕的微卫星DNA的体外基因组自我引发PCR扩增的条件。结果发现。浓度为100ng/μl的基因组DNA在100℃变性15min后，与等量的同浓度的未变性的DNA混合作为模板。在80m扩增体系中[含0．2mM dNTPs、50mM KCl、10mM Tris—HCl(pH9．0)、4mM MgCl2、1．25U Tap plymerase]，加入1μl此混合模板，在92℃，1min→55℃，2min→72℃，2min，30→90次循环的扩增条件下，成功地得到了PCR产物。基因组DNA的适宜浓度为1．25ng/μl反应体系；GSP—PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后的部分片段经回收后，在同样条件下，30—60个循环可得到同样大小范围的产物。GSP—PCR产物经6％的变性测序胶电泳，得到典型的梯状带，表明为微卫星DNA。