例析限制酶切割难题现象

<正>近年来,选择合适限制酶对目的基因和质粒进行切割似乎成为高考的一个热点,如江苏、天津等地的高考试题中,多次涉及限制酶切割目的基因和质粒的问题。由于考生对限制酶识别序列及切割点产生的黏性末端认识不清,导致该类试题时常成为难题。这类试题考查的能力主要包括以下几个方面。     

浅谈运载体和限制酶在基因工程中搭配应用

人教版高中生物学全一册教材基因工程一节,介绍了限制性内切核酸酶和运载体,阐明了重组DNA的构建过程：先用限制酶切割运载体（质粒）,产生黏性末端,再用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同黏性末端,加入DNA连接酶,即可形成重组DNA分子（也叫重组质粒）。学生学习完这部分内容之后,由于对限制酶和运载体搭配使用及基因检测知识认识不够深入,易产生错误。     

“基因工程”考点突破

考点突破考点一基因工程的基本操作工具(一)重点归纳1.与DNA分子相关的酶(1)几种酶的比较(2)限制酶与DNA连接酶的关系1限制酶不切割自身DNA的原因是:原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。2DNA连接酶起作用时不需要模板。2.载体(1)作用1作为运载工具,将目的基因转移到宿主细胞内。2利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。     

对“基因工程”专题中一些问题的分析

1从原核生物中分离纯化出来的限制酶是否会切割自身的DNA？构建好的重组质粒若以大肠杆菌等原核生物为受体细胞,是否会被其中的限制酶切开而不能起作用呢？     

基于问题驱动的“基因工程——限制酶”一节的复习教学设计

通过设置层层问题,帮助学生理解基因工程中限制酶的作用特点,其与电泳技术在目的基因及质粒获取中的具体应用,培养学生的逻辑思维的习惯和科学探究的能力.     

“转化”的定义与“影印法”——对2016年高考全国理综乙卷第40题的探讨

<正>1试题某一质粒载体如图1所示,外源DNA插入到Amp~r或Tet~r中会导致相应的基因失活(Amp~r表示氨苄青霉素抗性基因,Tet~r表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有3种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下     

人铁蛋白基因的克隆与原核表达

通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体．     

mCherry标签融合SATB1真核表达质粒的构建

核基质结合蛋白SATB1调控染色质的空间结构,参与真核生物基因表达。本论文通过PCR获得SATB1目的基因,然后与载体mCherry-C1同时用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后,用T4连接酶进行连接。连接质粒转入感受态宿主细胞并在Kana抗性的LB培养基中培养。分离获得Kana抗性单克隆菌株并进行扩大培养后提取重组质粒。对重组质粒进行双酶切验证和DNA测序检测。本论文成功构建mCherry-SATB1真核表达质粒,为后续研究SATB1的功能机制奠定基础。     

植物表达双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta的构建

本研究将苏云金芽孢杆菌（bt）与半夏凝集素抗虫基因（pta）两类抗虫基因连接到具有高效性的植物表达载体pCAMBIA3300中,重组表达质粒分别经过ApaⅡ单酶切及xhoⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定、分析后,实验结果表明含有双价抗虫基因pCAMBIA3300-bt-pta的植物重组表达质粒已构建成功。     

高中生物学教学中涉及的一些重要酶及其作用

1基因工程中的重要酶 1.1限制性核酸内切酶（简称＂限制酶＂）是可以识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA,使DNA链中磷酸二酯键断开的一类内切酶,被誉为＂分子手术刀＂。     

与核酸有关的几种酶的比较

<正>一、限制性核酸内切酶(限制酶)1.限制酶的来源:在基因工程中,用来切割DNA的工具是限制性核酸内切酶,又称限制酶。迄今为止,基因工程中所用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中分离纯化而来的,它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。微生物中限制酶之所以不切断自身DNA,是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完整的防御机制,可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期演化过程中,含有     

用字母代替数字分析确定酶切位点及图谱

<正>例1为了解基因结构,通常会选取某一特定长度的线性DNA分子,先用一种限制酶切割,通过电泳技术将单酶水解片段分离,计算相对大小,然后再用另一种限制酶对单酶水解片段进行降解,分析片断大小,表1是某小组进行的相关实验所得结果。表1     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白Vp28基因的克隆、表达及蛋白纯化

以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶（SmaI,Not I）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白．     

限制酶的多种切割方法及其在高考题中的体现

仔细研究近年来各地的生物高考题,发现限制酶的切割方法是高考中的热门考点。下面就对限制酶主要的切割方法进行分析总结,归纳其优缺点。     

人超氧化物歧化酶（SOD）基因的原核表达与蛋白纯化

从人直肠癌细胞株Colo320中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶（BamHI,Sinai）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约44kD相吻合的融合蛋白带,获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepha—rose4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白．     

水生植物凤眼莲Ca2＋-ATPase的原核表达与蛋白纯化

从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白．     

有关限制性内切酶应用的习题简析

特别提示： 我们知道限制性内切酶（限制酶）是指能识别DNA中特定破基顺序,并在特定位点切割双链DNA的核酸内切酶它在生物学中应用相当广泛,是基因工程中的工具酶,用来构连重组DNA分子,对于遗传性疾病的基因定位和基因诊断的研究也具有重要的应用价值。下面我们以问题的形式简要地了解它在这些方面的应用     

再谈限制酶

主要就Ⅱ限制酶的识别序列和切割位点做了一些说明,以纠正一些认识误区。另外对限制酶和甲基化酶的关系、限制酶发挥作用所需条件也有涉及。     

应用显微注射法建立免疫耐受转基因小鼠模型的研究初探

本论文用质粒载体PBC1-CD152转化大肠杆菌DH5a，以Amp(50mg／m1)筛选阳性单个菌落，LB培养基大量培养，按照质粒小量提取试剂盒使用方法抽提质粒，AVAⅠ、HindⅢ酶切和PCR扩增检测。可育雌鼠注射PMSG与HCG超排卵，输卵管内收集，移植受体母鼠输卵管腹壶部。结果表明：AVAⅠ酶切产物有一条为2．0kb的片段，证明是目的基因的启动子，从而证明质粒上含有我们所需的目的基因片段。HindⅢ酶切后出现一条带，与质粒的大小相符。共处理十批小鼠100只，有70只为可用供体，处理有效率为。70％，共捡胚1425枚，只均捡卵20．36枚。共处理受体小鼠十批40只，每只植入胚胎20枚，共出生小鼠274只，出生率为34．25％。本次实验成功扩增了免疫耐受诱导基因皮肤靶向表达载体PBC1-CD152，并以小鼠为动物模型，建立了完善的显微注射法转基因技术流程。     

凡纳滨对虾铁蛋白基因的克隆与表达

以凡纳滨对虾为研究对象,通过RT-PCR技术扩增出铁蛋白（Ferritin）基因,经特定的酶切（Notl,Smal）后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌．经菌落PCR和质粒双酶切鉴定确认,证实成功地构建了对虾铁蛋白基因的原核表达载体．再对重组菌用IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose4B亲和层析得到目的蛋白用于制备抗体,为研究铁蛋白在对虾抗病毒免疫中的作用奠定基础．