饲料中马、驴源性成分的分子生物学检测技术

本研究根据马、驴线粒体DNA中的保守区段设计了一对引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)采取马、驴、牛、羊、猪、鸡、兔、鹿、火鸡等实验材料进行扩增,可以专一地扩增出马、驴源性成分的DNA片段,再经限制性内切酶Sau 3A和Alu Ⅰ的酶切鉴定可以区分马源性成分和驴源性成分,PCR扩增产物的测序结果验证了酶切鉴定结果的正确性.引物灵敏度测试结果表明该方法的检测低限均达0.3%,该对引物可以成为检测马、驴源性成分高效准确的检测工具.     

PCR技术快速鉴别牛、羊、猪皮革的初步探讨

提取牛、羊、猪3种动物皮革组织中的DNA,设计了3对特异性引物,PCR扩增,初步建立了这4种动物皮革成分的鉴定方法。DNA的提取的质量及其后的PCR鉴定依赖于皮革的加工程度,如何从皮革成品中提取有效的核酸信息需进一步研究。     

小鼠超高硫角蛋白基因启动子的分子克隆及序列分析

根据小鼠超高硫角蛋白（UHS）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以小鼠全血提取的总DNA为模板,PCR扩增出688bp的特异性片段,连接到pMD19T载体中获得该片段克隆p19TU。经过快速提取质粒法筛选、限制性内切酶分析证明该克隆就是UHS基因5’端的调控区序列。序列分析结果也表明该克隆片段与原基因调控序列相比具有很高的一致性。研究结果为今后制备转基因克隆动物、在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础。     

大鼠脑源性神经营养因子的体外表达

目的构建复制缺陷型含大鼠脑源性神经营养因子基因的逆转录病毒,进行体外包装并检测病毒的表达,探讨神经损伤修复中的新途径。方法用体外连接的方法将脑源性神经营养因子基因和逆转录病毒pLXSN的酶切产物连接成重组逆转录病毒。利用脂质体转染法将重组逆转录病毒导入PA317包装细胞系中获取高滴度的分泌脑源性神经营养因子的病毒,检测病毒滴度并观察BDNF在鼠成纤维细胞中的表达情况。结果经PCR、酶切鉴定,脑源性神经营养因子基因已导入PA317细胞,并可在鼠成纤维细胞中表达。结论制备了含脑源性神经营养因子的重组逆转录病毒,为进一步研究脑源性神经营养因子治疗神经损伤性疾病奠定基础。     

浙江省12个主栽茭白品种亲缘关系的RAPD分析

采用RAPD技术构建了12个浙江主栽茭白品种的RAPD指纹图谱。利用河姆渡双季茭作为模板从50个随机引物中筛选出稳定且多态性高的7个引物用于茭白DNA的PCR扩增,共产生45条DNA片段,平均每个引物的扩增带为6.4条,其中15条扩增带具有遗传多样性。约占总DNA片段的33.3％。利用相似性聚类分析对PCR扩增产物进行二态性数据分析,结果表明,在相似系数2.1处可以将12个茭白品种分为5个聚类群,其中9个浙江本地品种间的遗传距离较近。初步结果也表明,单季茭与双季茭间的遗传差异比同一类型中茭白品种间的差异显著。     

基因敲除小鼠不同部位提取DNA方法的比较

目的:建立简便、快捷、稳定可靠的鉴定小鼠基因型方法,维护动物伦理福利。方法:基因敲除小鼠后代鉴定时,分别从鼠尾,鼠耳,趾甲三个部位提取DNA,通过优化DNA提取技术,经分光光度计检测,PCR扩增等技术,比较分析DNA纯度、提取时间,及基因型鉴定结果。结果:取组织提取DNA,经分光光度计检测,发现DNA浓度尾尖最高,耳尖次之,趾甲浓度最低,但是纯度最好。经PCR扩增技术发现不同基因型的不同部位提取DNA鉴定结果一致。结论:剪趾甲提取DNA操作方法相对于其他常规方法,操作简单,耗时最短,基因型鉴定结果可靠,对小鼠本身伤害更小,可用于规模化的小鼠基因型鉴定实验中。     

肺炎衣原体膜表面蛋白重组质粒的构建

目的 构建表达肺炎衣原体膜表面蛋白(OMP)的重组质粒，并在火肠杆菌中表达获得基因重组蛋白．方法用高保真PCR方法从肺炎衣原体扩增OMP片段．双酶切后插入原核表达质粒pQE-30，在大肠杆菌M15中表达，结果重组质粒经双酶切鉴定与目的基因长度相符；各表达蛋白经SDS-PAGE分析，相对分子量与文献相符．结论该重组质粒可用于核酸疫苗的备选质粒，基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于肺炎衣原体检测试剂盒的制备。     

用PCR技术筛选小分子DNA重组菌落的研究

为解决小分子DNA与质粒载体连接，转化入大肠杆菌后，蓝白斑不能很好鉴别非重组菌落与重组菌落的问题，本实验拟建立用PCR技术快速筛选小分子DNA重组菌落的方法，并对比研究特异引物扩增和通用引物扩增的可靠性。     

乳糖诱导Pfu DNA聚合酶基因的表达及酶的纯化

利用乳糖诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)中Pfu DNA聚合酶基因的表达。对诱导菌株起始生长量、乳糖浓度和诱导持续时间进行了优化,尝试使用JK110弱阳离子交换柱和Sephadex G-75凝胶层析柱来分离纯化Pfu DNA聚合酶,并用PCR扩增实验检测酶活性。结果表明乳糖可以有效诱导Pfu酶的表达,JK110离子交换柱有较好的纯化效果,从500 mL培养液中可以得到3×105U的酶活,比活达22,200 U/mg,结果好于IPTG诱导表达。     

T-Linker PCR技术

1993年凯利·穆利斯因为发明PCR技术而荣登诺贝尔颁奖台。什么是PCR?它是指“DNA聚合酶链式反应”(polymerase chain reaction, PCR), 其原理是:在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液的反应混合物中,在热稳定DNA聚合酶的催化下,对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。说得简单些,就是一种DNA分子的特异扩增技术,即将微量的特异DNA分子进行成倍扩增。PCR技术最大的优点在于它能