关于基因敲除技术的浅介

现今世界上最热门的科学课题之一是生物体的基因功能研究。基因敲除(gene knock-out)技术是研究基因功能最直接有效的一种遗传功能技术。该技术是科学家通过一定的方法使生物体内特定的基因缺失或失活的一种高科技技术。改变生物体的遗传基因,令特定的基因功能丧失,从而使部分功能被屏蔽,观察对生物体造成的影响,进而推测出这些基因的生物学功能。基因敲除技术主要是使用DNA同源重组原理,随着科学的进步和基因敲除技术的发展,除了同源重组以外,许多新的原理和技术也逐渐被采用,例如现今比较成功的基因敲除方法还有ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas技术等。笔者对基因敲除技术基本原理和其在各个方面的应用做了简要的介绍。     

浅谈"基因敲除"

鉴于近年来基因敲除频繁地出现在高中生物教材和试题中,又基于基因敲除与基因工程的联系以及基因敲除的广泛的应用价值,对基因敲除作了简单的探讨.     

“基因敲除”技术的研究与应用

基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶,是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点.2007的诺贝尔得奖项目就是用胚胎干细胞在小鼠特性基因修饰技术中的重大成就.这个重大奖项的颁发,使基因敲除这项高科技更加全面地展现在世人面前.这项技术从20世纪70年代一直发展至今,对人类作出了一定的贡献,但是由于技术要求比较高,因此还有很多缺点需要科学家共同努去克服,使其能在各个方面为人类作出更大的贡献.从基因敲除技术的发展趋势来看,它的前景会越来越广阔.     

“基因敲除”类信息题归类解析

本文从试题考查的知识点、考查的能力两个角度分析了"基因敲除"类信息题的类型及解题规律。知识点主要涉及生物工程、遗传规律和基因敲除技术的应用。试题的解答要求学生具备一定的知识迁移能力和分析问题、解决问题的能力。     

一种高效的柑橘绿霉菌基因敲除体系的构建(英文)

研究目的:提高柑橘绿霉菌基因敲除效率。创新要点:低效的基因敲除与丝状真菌非同源末端链接(NHEJ)的DNA双链断裂修复途径有关。为提高柑橘绿霉病菌基因敲除效率,本研究利用农杆菌介导的转化体系,获得NHEJ途径中关键因子Ku80的缺失突变体(ΔPdKu80)。研究方法:与野生型菌株相比,以ΔPdKu80作为出发菌株,提高柑橘绿霉病菌PdbrlA和PdmpkA的基因敲除效率(见表1)。重要结论:ΔPdKu80的营养生长、产孢和致病性与野生型菌株基本一致。ΔPdKu80作为出发菌株,能显著提高柑橘绿霉菌的敲除效率。     

sidt2基因敲除小鼠对肝脂类物质代谢的影响

目的：使用sidt2基因敲除小鼠模型来研究sidt2在肝脂类物质代谢中的作用.方法：用Cre/LoxP技术制作小鼠模型,采用RT-PCR技术检测sidt2的mRNA表达,蛋白印迹分析其蛋白的组织分布.与野生型小鼠相比,用酶法来分析sidt2-/-小鼠血清脂类物质、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶和血清胆红素等的变化.结果：通过sidt2的基因鉴定,获得基因敲除小鼠,并且发现sidt2-/-小鼠肝功能和脂类物质代谢异常.结论：缺乏溶酶体膜蛋白sidt2会导致肝功能和脂类物质代谢发生异常.     

LysR家族新基因kp05372对林麝肺炎克雷伯氏菌的作用的初步研究(英文)

目的:通过kp05372基因的敲除来研究其对林麝肺炎克雷伯氏菌生物表型的影响。创新点:解析了LysR家族新基因kp05372对林麝肺炎克雷伯氏菌生物表型的影响。方法:通过基因敲除和回补技术构建了kp05372的基因缺失株和基因回补株,比较了kp05372基因缺失前后,林麝肺炎克雷伯氏菌在生长曲线、药敏试验、生物被膜、抗逆性、细菌半数致死量、定殖能力、病理形态学等生物学特性所表现出的差异。结论:成功构建了kp05372基因的缺失株及回补株。kp05372基因的缺失导致林麝肺炎克雷伯氏菌耐药性和耐酸性发生了变化,毒力、生物膜和定殖能力降低,并且调控了上游临近区域的基因表达。     

浅谈“基因敲除”

基因敲除是20世纪80年代末发展起来的新型分子生物学技术,通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。     

白念珠菌CaPDE2基因的敲除与功能研究

构建白念珠菌CaPDE2基因缺失株,研究其功能.通过PCR扩增构建含有CaPDE2基因同源臂100 bp的SAT1-flipper敲除盒,用于敲除CaPDE2第一等位基因;然后通过构建CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒(同源臂700～1 000 bp),敲除CaPDE2第二等位基因.将CaPDE2基因缺失株依次培养在YPD+25μg/mL ClonNAT、YPD+0.1%5-FOA培养基中,以去掉SAT1和URA3基因筛选标记;通过CaPDE2基因缺失株的表型试验初步检测了CaPDE2基因的功能.结果表明:联合采用URA3和SAT1筛选标记完成CaPDE2双等位基因的敲除,得到了CaPDE2基因缺失株,并去掉SAT1和URA3基因标记,其基因型为Capde2::FRT/Capde2::hisG. Ca PDE2基因缺失株对酮康唑、氟康唑、十二烷基硫酸钠及42℃均敏感.因此,CaPDE2参与调节白念珠菌抗真菌药物、细胞膜压力及高温的耐受性.     

面向非生物学专业的CRISPR/Cas9基因编辑实验教学的设计与实践

文章以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础,设计了面向非生物专业学生的“利用基因编辑技术建立靶基因敲除细胞系”实验课程。实验包括验证性和探索性内容,整合了生物信息学、分子生物学、细胞生物学、基因工程等多学科知识点,有利于加强学生对相关生命科学知识的理解,有利于提高学生综合实验设计能力和培养创新精神。     

Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era

To solve the problem of embryonic lethality in conventional gene knockouts,site-specific recombinase(SSR)systems(Cre-loxP,Flp-FRT,andΦC31)have been used for tissue-specific gene knockout.With the combination of an SSR system and inducible gene expression systems(tetracycline and tamoxifen),stage-specific knockout and transgenic expression can be achieved.The application of this"SSR+inducible"conditional tool to genomic manipulation can be extended in various ways.Alternatives to conditional gene targeting,such as conditional gene trapping,multipurpose conditional alleles,and conditional gene silencing,have been developed.SSR systems can also be used to construct precise disease models with point mutations and chromosomal abnormalities.With these exciting achievements,we are moving towards a new era in which the whole genome can be manipulated as we wish.     

Magnaporthe oryzae MTP1 gene encodes a type Ⅲ transmembrane protein involved in conidiation and conidial germination

In this study the MTP1 gene, encoding a type Ⅲ integral transmembrane protein, was isolated fi'om the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Mtpl protein is 520 amino acids long and is comparable to the Ytpl protein of Saccharomyces cerevisiae with 46% sequence similarity. Prediction programs and MTP1-GFP (green fluorescent protein) fusion expression results indicate that Mtpl is a protein located at several membranes in the cytoplasm. The functions of the MTP1 gene in the growth and development of the fungus were studied using an MTP1 gene knockout mutant. The MTP1 gene was primarily ex-pressed at the hyphal and conidial stages and is necessary for conidiation and conidial germination, but is not required for patho-genicity. The △mtpl mutant grew more efficiently than the wild type strain on non-fermentable carbon sources, implying that the MTP1 gene has a unique role in respiratory growth and carbon source use.     

Magnaporthe oryzae MTP1 gene encodes a type III transmembrane protein involved in conidiation and conidial germination

In this study the MTP1 gene, encoding a type III integral transmembrane protein, was isolated from the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Mtp1 protein is 520 amino acids long and is comparable to the Ytp1 protein of Saccharomyces cerevisiae with 46% sequence similarity. Prediction programs and MTP1-GFP (green fluorescent protein) fusion expression results indicate that Mtp1 is a protein located at several membranes in the cytoplasm. The functions of the MTP1 gene in the growth and development of the fungus were studied using an MTP1 gene knockout mutant. The MTP1 gene was primarily expressed at the hyphal and conidial stages and is necessary for conidiation and conidial germination, but is not required for pathogenicity. The Deltamtp1 mutant grew more efficiently than the wild type strain on non-fermentable carbon sources, implying that the MTP1 gene has a unique role in respiratory growth and carbon source use.     

RNAi鉴定药物靶点及siRNAs治疗疾病

RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）所诱导的一种特异性基因沉默现象。RNAi是生物体进化过程中抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制,是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制,具有重大生物学意义。RNA干扰技术的发现及其作为基因敲除工具在模式生物、哺乳动物细胞和体内的成功应用的例子确保了它在药学研究中的作用。越来越多的研究显示RNAi在药物研发中显示出极大潜力,目前已有部分RNAi药物进入临床试验阶段。本文将从两个方面来论述RNAi在药学的应用：一是RNAi在药物靶点鉴定中的运用;二是siRNAs作为药物在疾病治疗中的作用。     

论人口素质对经济发展的促进作用

从本质上说,经济发展的竞争取决于人口素质的高低和人力资本的积累。通过实证研究,发现经济发展水平受到人口素质的显著影响,并通过定性分析论述了提高人口素质对劳动生产率提高、技术进步和产业结构优化的促进作用。＂人口红利＂消退、人口素质＂逆淘汰＂这两类人口问题对经济发展有影响。     

Kir6.2构成的ATP敏感性钾通道在苯环己哌啶诱导的精神分裂症阴性症状中的作用

目的:ATP敏感性钾(K-ATP)通道对多巴胺和谷氨酸能传导具有重要的调节作用,而多巴胺和谷氨酸能传导之间相互作用是精神分裂症病理机制的重要神经化学基础.因此,我们应用Kir6.2(主要表达在神经元的K-ATP亚基)敲除小鼠,通过苯环己哌啶诱导强迫游泳不动时间的延长,模拟精神分裂症的阴性症状,从而研究K-ATP通道在其中的作用.方法:连续注射14d苯环己哌啶(10 mg·kg-1,i.p.)后,通过观察强迫游泳实验中小鼠不动时间的长短,评价Kir6.2敲除对精神分裂症阴性症状中抑郁样表现的影响;应用高效液相色谱联合电化学检测法观察纹状体多巴胺及其代谢产物、多巴胺更新率的改变;应用溴脱氧尿嘧啶核苷插入法观察海马齿状回颗粒下区神经干细胞增殖的改变;应用Western blot技术观察磷酸化Akt水平的变化.结果:Kir6.2敲除取消了苯环己哌啶引起的强迫游泳不动时间的延长.不仅如此,Kir6.2敲除还抑制了苯环己哌啶诱导的纹状体多巴胺更新率的增加、海马齿状回颗粒下区神经干细胞增殖的减弱,以及磷酸化Akt水平升高.结论:Kir6.2组成的K-ATP通道参与了苯环己哌啶诱导的精神分裂症阴性症状,阻断K-ATP通道有望成为治疗精神分裂症的新策略.     

论基因的版权与专利权保护

在人类已经步入新千年之际,生物基因工程技术的突飞猛进给人类社会带来空前机遇的同时,也提出了的挑战。在此背景下,文章着重研究了在知识产权法律框架下如何对生物基因进行法律保护的问题,通过比较分析版权保护与专利权保护,提出了以专利制度为基础以基因进行保护的观点。并阐述了基因专利保护所面临的问题及其对策。     

油菜中与细胞质雄性不育相关基因的研究现状

目前,油菜中与细胞质雄性不育相关基因的研究,主要表现在对细胞质雄性不育基因．核质互作雄性不育基因和育性恢复基因等的遗传性状观察、分子标记、基因定位、基因表达和生产应用等方面,本文从这些方面进行综述,并提出了展望。     

传统聚落景观基因的环境教育特征探析

在当今的新形势下,探索传统聚落景观基因资源与构建生态文明战略相结合的环境教育内容体系创新与实施途径具有重要的社会价值。本文结合传统聚落景观基因理论,在深入分析传统聚落景观基因所具有的环境意识特征和所体现的生态环境价值观的基础上,明确了景观基因的环境教育内涵,分析了景观基因对古代环境生态观的传承、认知与体验功能。在前述基础上,本文就实施以景观基因为特色的环境教育的基本途径做了探讨。该文的研究结果表明,将我国传统聚落所体现的生态环境特征纳入到当前的环境教育内容体系当中,是一个值得深入的课题。