用于表达多肽抗原融合基因的杆状病毒系统

以含翻译起始密码子ATG的质粒pSⅪⅤⅥ Ⅹ3/4为转移载体,将多角体蛋白及切除部分5′和3′端的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)基因同时插入粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)基因组中,构建了形成多角体的重组毒株。该毒株能利用合成—多角体ⅪⅤ串联启动子,表达由截短的HBcAg序列及其上下游多接头与杆状病毒DNA部分序列组成的融合蛋白基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Wcstern印迹与免疫电镜观察的结果表明,融合蛋白基因表达产物的分子量约20.5KD,与理论计算值相符,并保留了HBcAg的抗原性,亦能形成典型的HBcAg颗粒。组建含多克隆点及截去两端序列的HBcAg基因转移载体质粒,使编码多肽抗原的寡聚核苷酸易于克隆,以HBcAg融合蛋白方式在杆状病毒载体系统中表达,并能形成HBcAg为蛋白载体的抗原颗粒结构。     

蕲蛇酶对脑梗塞患者血浆t—PA、PAI活性的影响

蕲蛇酶具有降解纤维蛋白原、降低血粘度及改善微循环等作用,对脑梗塞有治疗作用组织型纤溶酶原激活物(1-PA)及纤溶酶原激活物抑制物(PAI)是反映机体纤溶系统功能状况的两个重要指标。本研究通过测定脑梗塞患者蕲蛇酶治疗前后血浆t-PA、PAI活性来了解该药对机体纤溶系统的影响。1 临床资料1.1 一般资料 全部病例按全国第二届脑血管病会议通过的诊断标准诊断为急性脑梗塞患     

杆状病毒后期启动子在大肠杆菌中启动CAT基因表达的研究

以CAT基因为报道基因,探讨了杆状病毒后期启动子在大肠杆菌中启动表达CAT基因的活性。结果显示在不含多角体基因及其启动子的质粒中,具合成启动子的表达量最高,野生型多角体启动子的表达量次之,而含ⅩⅣ多角体启动子的最低;具相同CAT基因启动子的质粒中,含多角体蛋白基因及其野生型启动子者较不含者强,含合成与ⅩⅣ启动子串联组合者与单纯ⅩⅣ启动子者表达量近乎一致,但均较前者为弱。以上结果表明,杆状病毒后期启动子在大肠杆菌与在昆虫细胞中的启动表达的能力并非完全一致。     

鸭疫里默氏杆菌的GAPDH同源体:一种有生物活性的胞外蛋白(英文)

研究目的:对鸭疫里默氏杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)进行鉴定和生物学特征分析。创新要点:首次证实鸭疫里默氏杆菌具有GAPDH的同源体酶(RaGAPDH)是一种无信号肽和跨膜区的胞外蛋白酶,具有将3-磷酸甘油醛转化为1,3-二磷酸甘油酸的活性,可与纤维蛋白溶酶原及纤维蛋白原发生结合,推测该酶可能是鸭疫里默氏杆菌的一个新发现的毒力因子。研究方法:1.对分离自重庆、四川地区的鸭疫里默氏杆菌(表1)菌体细胞表面蛋白(图1a)和CZ2、SC12、YC1三株菌胞外蛋白(图1b)的GAPDH活性进行检测,对其编码基因进行PCR鉴定(图2)和克隆测序分析(图3);2.采用染色体步移技术获得CZ2的GAPDH编码基因进行原核表达(图4a和4c);3.以获得的具有活性的重组GAPDH为抗原,制备鼠原多克隆抗体并采用Western-blot方法对鸭疫里默氏杆菌的胞外分泌蛋白进行检测分析(图4b);4.采用固相配体结合试验检测RaGAPDH与纤维蛋白溶酶原、血纤维蛋白原、肌动蛋白和纤连蛋白的结合作用(图5)。重要结论:鸭疫里默氏杆菌具有三磷酸甘油醛脱氢酶同源体,具有GAPDH活性,能与纤维蛋白溶酶原和血纤维蛋白原结合,可能是其重要的毒力因子。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ型在E.coli和家蚕中的表达

将hIGF-I基因克隆进原核表达载体pET-28a( ),在E.coli中进行了融合表达,West-ern blotting显示在26 kD附近有一条特异条带。将hIGF-I基因克隆进pBacPAK-8,获得了杆状病毒转移载体pBacPAK-8-IGF-I,在脂质体的介导下,与线性化的家蚕杆状病毒共转染家蚕培养细胞Bm-N,经空斑筛选,PCR检测,获得了重组病毒Bm-Bac-hIGF-Ⅰ。SDS-PAGE检测表明,在感染重组病毒后,家蚕幼虫血淋巴中可以检测到一条分子量约为7.5 kD的特异性条带,ELISA检测表达量达4.51μg/mL蚕血淋巴。     

动脉粥样硬化性心脑血管疾病患者血浆脂蛋白(a)水平与纤溶活性的关系

目的 :为了研究动脉粥样硬化性心脑血管疾病患者血浆脂蛋白 (a)水平与纤溶活性的关系 ,探讨脂蛋白 (a)促血栓形成和致动脉粥样硬化的机理。方法 :分别测定 4 2例心肌梗塞患者、4 2例心绞痛患者、4 4例脑梗塞患者及 38名健康对照者的脂蛋白 (a)浓度、组织型纤溶酶原激活剂 (tPA[lj1])及其抑制物 (PAI)活性 ,并分析其相关性。结果 :各组动脉粥样硬化性心脑血管疾病患者血浆脂蛋白 (a)浓度和PAI活性明显升高 ,tPA活性明显降低 ;各组脂蛋白 (a)与PAI活性均呈显著正相关。结论 :血浆高脂蛋白 (a)浓度是动脉粥样硬化性心脑血管疾病的主要危险因素之一 ,脂蛋白 (a)水平的升高与纤溶活性低下有关     

用尿激酶、去纤酶治疗急性心肌梗塞时体内纤溶系统的改变

本文对25例用尿激酶、15例用去纤酶溶栓治疗的急性心肌梗塞患者体内的组织型纤溶酶原激活剂(tissue Plasminogen Activator,t-PA)的含量、活性及纤溶酶原激活剂抑制物(Plasminogen Activator Inhibitor,PAI)的活性在治疗前后的改变进行了动态观察。结果表明:(1)尿激酶可以显著地提高t-PA的活性,降低PAI的活性,这种作用在用药后0.5h最明显,维持4h左右,去纤酶则无此作用。(2)尿激酶组的再通率(76％)显著高于去纤酶组的再通率(20％),住院病死率12％,低于去纤酶组20％。两组的出血并发症相等,均为20％。提示:尿激酶可以有效地提高急性心肌梗塞患者的纤溶活性,去纤酶用于溶栓治疗可能无效。     

老年缺血性脑卒中患者血清载脂蛋白与组织型纤溶酶原激活剂及其抑制物的相关性

目的：探讨载脂蛋白A1、B100与老年缺血性脑卒中患者组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）及其抑制物（PAI）活性的关系。方法：对52例老年缺血性脑卒中患者和50例健康人用免疫比浊法测定血清载脂蛋白A1、B100浓度，并以发色底物法测定血浆组织型纤溶酶原激活剂及抑制物的活性。结果：老年缺血性脑卒中患者载脂蛋白B100，纤溶酶原激活剂抑制物的活性显著高于对照组（P〈0．05和P〈0．01），载脂蛋白A1与组织型纤溶酶原激活剂均降低（P〈0．05和P〈0．01），相匹配的缺血性脑卒中及对照组19例的相关分析发现载脂蛋白B100与组织型纤溶酶原激活剂活性无关，而与纤溶酶原激活剂抑制物活性呈正相关（r=0．8330），载脂蛋白A1与纤溶酶原激活剂抑制物活性呈负相关（r=-0．6734）。结论：载脂蛋白A1、B100浓度与纤溶酶原激活剂抑制物活性之间存在相关关系，而载脂蛋白B100与纤溶酶原激活剂抑制物呈正相关，载脂蛋白A1与纤溶酶原激活剂抑制物活性呈负相关。     

慢性肾功能衰竭患者血浆脂蛋白(a)与纤溶活性的相关性

目的:研究慢性肾功能衰竭患者血浆脂蛋白(a)与纤溶活性的关系.方法:应用酶联免疫吸附法分别测定58例慢性肾功能衰竭患者及51名健康对照者的血浆脂蛋白(a)浓度,并以底物显色法测定其组织型纤溶酶原激活剂(tPA)及其抑制物(PAI)活性.结果:慢性肾功能衰竭患者血浆脂蛋白(a)浓度和PAI活性明显升高,tPA活性明显降低;脂蛋白(a)浓度与血浆尿素氮水平、PAI活性均呈正相关;脂蛋白(a)浓度与tPA活性呈负相关.结论:肾功能对血浆脂蛋白(a)浓度起一定的调节作用,脂蛋白(a)水平的升高与纤溶活性低下有关.     

昆虫杆状病毒在生物技术研究中的应用

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入，昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体，在昆虫细胞和虫体内表达外源基因，形成了昆虫杆状病毒载体表达系统，利用杆状病毒携带外源基因，通过同源重组将外源基因导入到家蚕的基因组构建了转基因家蚕；通过向杆状病毒基因组中插入毒素、激素、酶抑制剂等的基因或从杆状病毒基因组中删除某个基因，或通过不同杆状病毒间的杂交，使子代病毒的宿主域扩大，从而提高了杆状病毒作为生物杀虫剂的杀虫效果。本文对杆状病毒在上述几个方面的应用进行了简要综述。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白通过未折叠蛋白反应诱导凋亡（英文）

目的:确定猪圆环病毒2型衣壳蛋白(PCV2)感染引起未折叠蛋白反应的关键病毒蛋白,以及探究PCV2感染中未折叠蛋白反应与凋亡之间的联系。创新点:本文首次鉴定出PCV2感染引起未折叠蛋白反应的关键病毒蛋白。方法:构建表达病毒蛋白的真核表达载体,通过瞬时转染PK-15细胞,采用免疫印迹检测未折叠蛋白反应通路的关键分子;利用RNA干扰抑制perk基因的表达来验证激活的通路;通过抑制内质网上游分子PERK并利用免疫印迹和流式细胞术检测凋亡,研究内质网应激与凋亡之间的联系。结论:PCV2 Rep和Cap蛋白能激活PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路,PERK通路在Cap诱导的细胞凋亡中起重要作用。     

人B淋巴细胞刺激因子的可溶性功能区（hsBLys）的克隆、表达及分离纯化

在已有的pET30a/hs表达载体的基础上，构建了原核表达载体pET30a/hsBLYS(His6)、经双酶切分析和DNA测序后，转化入表达宿主大肠杆菌M15，IPTG诱导后得到高效表达(目的蛋白约占总菌蛋白的35％)；表达产物大部分以包含体形式存在。采用本室自行研制的Ni^2 亲和层析胶(Ni^2 —IDA)纯化可溶部分的重组融合蛋白，经SDS—PAGE鉴定为单一条带。     

应用人延伸因子1α亚基启动子和人工转录激活因子提高外源基因在CHO细胞中的表达

来大志、翁少洁、于长明、齐连权、付玲、于婷、陈薇在《生物化学与生物物理进展》2004年第2期撰文指出:表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要.而表达载体中最为重要的元件是启动子,一些常用病毒来源的启动子,如巨细胞病毒即早期启动子(PCMV-IE)仅在S期激活,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖,这对于连续持久大规模培养的宿主细胞不现实.而人延伸因子1α亚基启动子(PEF-1α)不受细胞周期限制,且启动子强度高于PCMV-IE,对于大规模外源蛋白的生产较为理想.首先构建了基于PEF-1α启动子的哺乳动物细胞表达载体pED5,在增     

斑节对虾杆状病毒(MBV)PCR和核酸探针检测方法的建立与应用

从感染斑节对虾杆状病毒（MBV）的斑节对虾仔虾肝胰腺中纯化MBV，经抽提后以之为模板进行聚合酶链反应（PCR），引物根据苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）多角体蛋白基因序列的高度保守区设计并合成．PCR扩增得到650b单一核苷酸片段．PCR产物部分序列分析表明此PCR产物与AcNPV多角体蛋白基因序列有约60％的同源性．以此650pDNA片段为探针作打点杂交，探针能与受MBV感染的斑节对虾肝胰腺和消化道中抽提的总DNA杂交，不能与其它组织中抽提的总DNA杂交．应用PCR方法检测MBV的组织特异性，得出与打点杂交相同的结果；检测斑节对虾各生长阶段及卤虫感染MBV情况，认为MBV可能为水平传播；PCR检测方法与组织学方法比较，认为前者更加敏感．     

一株新的大口黑鲈弹状病毒(YH01)的分离、鉴定及其糖蛋白的杆状病毒表达系统的构建（英文）

目的:探究大口黑鲈弹状病毒株与其他已知弹状病毒的差异,构建该病毒糖蛋白的杆状病毒表达系统,用于后续口服疫苗的研发。创新点:基于获得的大口黑鲈弹状病毒的全基因组序列,并利用杆状病毒表达系统获得了高丰度的病毒糖蛋白,可结合家蚕用于后续口服疫苗的研发。方法:利用c DNA末端快速扩增法(RACE)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等技术获得了病毒的部分序列,拼接获得了病毒的全基因组序列。通过ClustalW比较该病毒与已知弹状病毒的3'leader及5'trailer序列差异,进一步利用MEGA软件比较该病毒全基因组序列与其他鱼类弹状病毒的差异,确定其系统进化树中的分支及地位。基于糖蛋白序列分析结果,利用杆状病毒表达载体构建该病毒的糖蛋白表达系统,感染昆虫卵巢细胞(SF9)后,借助荧光定量PCR(q RT-PCR)、免疫荧光及蛋白质印迹法(western blot)等技术确定病毒增殖及糖蛋白的表达情况。结论:该大口黑鲈弹状病毒株全长11 526 bp,且与鳜鱼弹状病毒为同一分支,属于水泡病毒属。构建的病毒糖蛋白杆状病毒表达系统成功在SF9细胞中表达了高丰度的糖蛋白。     

灰斑古毒蛾核型多角体病毒几丁质酶基因及其分子进化

通过对构建的灰斑古毒蛾Orgyia ericae单粒包埋型核型多角体病毒(OrerSNPV)基因组DNA的EcoRI酶切片段质粒文库的测序分析,在EcoRI—J片段(6．4kb)中鉴定出了编码几丁质酶(ChiA)基因开放阅读框(ORF),chiA基因编码区由1695bp组成,编码564个氨基酸,预计蛋白质分子量为62kD。这也是首次在基因序列水平上研究OrerSNPV。将OrerSNPV ChiA氨基酸序列与其它已知的18种杆状病毒ChiA氨基酸序列联配比较,结果表明OrerSNPV与其它杆状病毒ChiA氨基酸有60．3—69．5％同源性,其中与BmNPV、CfDEFNPV和LdMNPV的同源性最高。根据氨基酸序列绘制的分子进化树表明杆状病毒chiA基因至少可以分为SlMNPV、GV和其它NPV三个分支,OrerSNPV与LdMNPV在进化树上关系最为接近。     

肾脏病与纤溶酶原的实验研究

<正> 纤溶酶原(Pg)是纤溶系统中的一种重要酶类,通过检测肾脏病人血清中的 Pg 含量变化,为临床在诊断治疗和科研方面提供“纤溶”或“活血化瘀”的参考依据,现将研究结果报告如下。     

木毒蛾质型多角体病毒的应用研究

木毒蛾（Ｌｙｍａｒｔｒｉａｘｙｌｉｎａｗｉｎｂｏｅ）是福建省沿海木麻黄防护林的重要害虫，利用木毒蛾质型多角体病毒（ＬｘＣＰＶ）防治本毒娥，防治效果达７９．７％以上．同时用木毒蛾质型多角体病毒与木毒蛾核型多角体病毒混合感染木毒蛾幼虫，死亡率为１００％．用粗提纯病毒配制成乳剂，在室温下．存放７４０天，仍保持较强感染力．用ＬｘＣＰＶ对家兔、鸽、鸡、小白鼠、金鱼等五种动物做急性毒性和亚毒性试验，试验结果以上动物无异常．用ＬＸＣＰＶ降解的病毒粒子攻击组织培养的ＦＬ，２ＢＳＢＨＫ，Ｃ６／３６细胞，未发现细胞病变和病毒增殖。     

Txt5腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达

设计小鼠Txt5基因的特异性引物,将小鼠c DNA作为模板,用PCR扩增出m Txt5编码区,并加入HA标签序列.将这一片段插入p MD-18T载体,再亚克隆至p Adtrack-cmv穿梭载体上.线性化后,转化BJ5183感受态细胞,在BJ5183中发生同源重组获得p Ad-Txt5质粒.p Ad-Txt5线性化后转染293A细胞,包装得到含Txt5基因的病毒.将病毒溶液感染大鼠原代心肌细胞,一段时间后观察绿色荧光,然后通过RT-PCR和免疫印迹法检测HA标签蛋白的表达.结果表明成功构建小鼠Txt5腺病毒表达载体并实现在大鼠原代心肌细胞中的表达.     

新城疫病毒感染对小鼠肉瘤S180细胞p53蛋白的表达及细胞周期的影响

目的:研究新城疫病毒(NDV)感染对小鼠肉瘤S180细胞p53蛋白的表达及细胞周期的影响。方法:通过NDV体外感染小鼠肉瘤S180细胞,经倒置显微镜观察细胞形态变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测小鼠肉瘤S180细胞的增殖状况;经流式细胞仪分析检测NDV体内感染后荷瘤鼠腹水中S180细胞分裂周期各时相的变化、细胞凋亡情况及细胞表面p53蛋白的表达情况。结果:NDV体内、外感染对小鼠肉瘤S180细胞的杀伤作用明显,NDV体内感染后荷瘤鼠腹水中S180细胞高表达p53蛋白,细胞凋亡率增加,G2/S期细胞减少,增殖指数(PI)降低,与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:NDV感染可增强小鼠肉瘤S180细胞p53蛋白的表达,影响其细胞周期,诱导其凋亡且有较强的杀瘤作用。