灰斑古毒蛾核型多角体病毒几丁质酶基因及其分子进化

通过对构建的灰斑古毒蛾Orgyia ericae单粒包埋型核型多角体病毒(OrerSNPV)基因组DNA的EcoRI酶切片段质粒文库的测序分析,在EcoRI—J片段(6．4kb)中鉴定出了编码几丁质酶(ChiA)基因开放阅读框(ORF),chiA基因编码区由1695bp组成,编码564个氨基酸,预计蛋白质分子量为62kD。这也是首次在基因序列水平上研究OrerSNPV。将OrerSNPV ChiA氨基酸序列与其它已知的18种杆状病毒ChiA氨基酸序列联配比较,结果表明OrerSNPV与其它杆状病毒ChiA氨基酸有60．3—69．5％同源性,其中与BmNPV、CfDEFNPV和LdMNPV的同源性最高。根据氨基酸序列绘制的分子进化树表明杆状病毒chiA基因至少可以分为SlMNPV、GV和其它NPV三个分支,OrerSNPV与LdMNPV在进化树上关系最为接近。     

低温几丁质酶chiA基因克隆、同源建模及序列分析

从假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)中克隆低温几丁质酶chiA基因(Gen Bank登录号KF234015)。该序列全长3160个核苷酸,编码1053个氨基酸,预测相对分子质量113.5 KDa,等电点(pI)4.49,命名为chiA。功能结构域分析显示其编码区包含信号肽、2个几丁质结合域、2个成人多囊肾病结构域、18家族几丁质酶催化域与18家族糖苷水解酶C端部分序列。利用Discovery Studio平台以同源建模的方法构建低温几丁质酶chi A的催化域三维结构模型,并对其进行结构优化和评估,Ramachandram图谱检测和Verify-3D评估显示模拟出的模型结构合理,整体的相容性较为可信。本结果拟为后期低温几丁质酶chiA的催化机理研究提供理论依据。     

珙桐rbcL基因的克隆与序列分析

根据已知植物rbcL基因设计引物,以珙桐叶片总DNA为模板,PCR扩增目的DNA片段,克隆入pDM19-T载体.阳性克隆鉴定后进行测序,序列分析结果表明:该基因片断长为1266 bp,包括1031 bp的编码区序列,编码343个氨基酸;其编码区氨基酸与烟草、菠菜、玉米、甘薯、拟南芥、水稻、葡萄、地钱和葡萄柚等9个物种的同源性94.13%以上,并构建了它们间的亲缘关系树.该基因片断的预测晶体结构与菠菜的最相近,推测Lys86、Lys60、Lys179等残基对酶的活性影响较大.     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该1条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明：该基因为放线菌来源chs基因．分别在该基因5＇末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoRI酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple—T／chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点（PI）为5．41、分子量为3965道尔顿含有cHs保守功能区的酸性蛋白质．分析表明,该基因与Streptomyceslividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87．70％．测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中．     

牛ANGPTL1基因的电子克隆与序列分析

以牛的ANGPTL1基因为研究对象,利用生物信息学方法,对牛的ANGPTL1基因进行了电子克隆和序列分析,并对推导出的ANGPTL1蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛的ANGPTL1基因序列长为2576 bp,该基因的编码序列长为1 476 bp,编码492个氨基酸,编码序列的两翼有135 bp的5’非编码区和785 bp的3’非编码区。DNA序列的G+C百分含量为44.31%,A+T百分含量为55.69%。该基因的核苷酸序列与人、黑猩猩、鼠和狗ANGPTL1基因的cDNA序列的相似性分别为91%、90%、82%和93%。在氨基酸序列上与人、黑猩猩、鼠和狗的相似性分别为95%、95%、92%和95%。用氨基酸序列构建的进化树显示,在人、牛、黑猩猩、狗、褐鼠、原鸡几种动物中,牛与狗的亲缘关系最近。     

小麦SOD基因的电子克隆及生物信息学分析

以NCBI中的EST数据库为主要数据来源,以一系列生物信息学软件为工具,进行了超氧化物歧化酶（SOD）基因的电子克隆及生物信息学分析。结果表明：通过电子克隆方法获得了SOD基因的编码区全长序列,该预测的SOD蛋白质氨基酸序列与数据库中同类基因的蛋白质氨基酸序列具有极高的相似性,并且含有完整的保守结构域;电子克隆到的SOD基因编码的不是分泌蛋白,也不是膜蛋白,而是胞质蛋白。通过某个基因的一个EST序列采用电子克隆的手段进行基因全长的电子拼接是可行的。     

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)查尔酮合成酶基因OvCHS的克隆与序列分析

根据GenBank发布的基因序列,设计PCR引物,分别从诸葛菜(Orychophragmus violaceus)的花瓣基因组DNA和cDNA克隆到查尔酮合成酶基因,并定名为OvCHS,序列已上传至NCBI数据库,登陆号为EF408918。序列分析表明,OvCHS基因的基因组全长为1263 bp,具一个75 bp的内含子,编码区全长为1188 bp,编码395个氨基酸。与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)查尔酮合成酶基因AtCHS比较发现,两基因编码区有135个碱基不同,相似性为88.64%,氨基酸序列中仅16个氨基酸残基的差异,相似性达95.95%。     

鸡γ-干扰素的克隆和序列分析

根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用primer 5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序,测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列比较,两序列间同源性为100%.计算机软件对鸡γ-干扰素编码的氨基酸序列进行了抗原性分析,结果表明鸡γ-干扰素具有良好的免疫原性.     

花生苹果酸脱氢酶基因的克隆及其蛋白序列分析

根据已知植物的苹果酸脱氢酶基因序列设计简并引物,采用RT-PCR技术从花生叶片中克隆得到苹果酸脱氢酶基因,命名为Ah MDH,Genbank登录号为KF499119,该基因编码区长度为1071bp,编码356个氨基酸。序列比对结果表明,Ah MDH编码蛋白与大豆、蒺藜苜蓿和豌豆等具有较高的相似性。     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒(NDV)ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

Nodal基因的剪接异构体分析

利用GenBank数据库中Nodal分子的核酸和蛋白相关信息,采用生物信息学方法分析Nodal的分子生物学特征及其剪接异构体.应用基因克隆方法克隆人Nodal基因.结果表明Nodal基因至少有四种剪接异构体,除研究较清楚的isoform 1相对完整外,其它剪接异构体信息并不完整、功能未知且表达可能有组织特异性.特别是虽然Nodal基因isoform 1的氨基酸编码序列已知,但是发现目前NCBI提供的Nodal基因mRNA参考序列并不完整.通过基因克隆发现一种新的Nodal基因剪接异构体,它可能具有TGF-β超家族的特征性结构,但功能未知.结果说明人Nodal基因可能至少存在5种剪接异构体,除isoform 1外,其它isoform具体功能还有待进一步研究.     

来自水稻伴生生物一个cDNA片段的序列分析

利用反转录聚合酶链式反应的方法，以单引物R2为引物，从水稻伴生菌中克隆到了一cDNA片段，长1029bp，其中开放阅读框部分共编码220个aa。NcBI核苷酸序列同源性比对结果表明：开放阅读框部分与大肠杆菌、志贺菌和沙门氏菌有较高的同源性，但在3’非翻译区几乎没有同源性；多肽序列的同源性比对结果显示，R2在N-端比目前已知的四氢叶酸脱氢酶/环化酶多肽序列少50个aa，C-端少18个aa。通过http://www.fruitfly.org网站下的启动子预测软件未发现转录起始位点，在3’端也无AATAAA加尾信号，因此我们克隆的cDNA不是完整的基因序列。通过功能结构域预测和三维结构分析表明：R2存在多个功能结构域，即FolD、KOG4230、THF_DHG_CYH_C、KOG0089和THF_DHG_CYH，其中KOG0089和THF_DHG_CYH_C为R2蛋白所包含的完整的功能结构域，晶体模型显示其分子表面凹凸不平，分子内存在间隙，总能为-5243．076kJ／mol，存在两个GROMOS程序修复点即Gly^53Gly^187，有7个类似于Aal^83和Leu^86的锚定连接形成两个环状结构。     

七鳃鳗含硒谷胱甘肽过氧化物酶2的分子克隆、生物学特性及表达分析

谷胱甘肽过氧化酶2(GPx2),是生物体内重要的一类抗氧化酶,能够通过酶解过氧化氢阻断活性氧(ROS)的有害作用。本研究从七鳃鳗的血液c DNA文库中克隆了GPx2 c DNA全长和基因组DNA序列。序列分析表明,其c DNA全长为868 bp(Gen Bank序列号KM211710),包括53bp 5′非编码区、251bp 3′非编码区和564 bp开放阅读框,编码由187个氨基酸组成的多肽。基因组DNA序列(Gen Bank序列号KM211711)揭示了基因组特征含有2个外显子和1个内含子结构。系统发育分析表明,七鳃鳗GPx2(Lj GPx2)与其它的GPx2具有很高的同源性。利用实时荧光定量PCR检测到GPx2基因在七鳃鳗各组织中广泛表达,其中在口腔腺、心脏、卵、生殖腺中表达量较高。此外,用脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后发现,Lj GPx2 m RNA在生殖腺中表达量显著升高。本研究为探讨GPx2在七鳃鳗的免疫应答中的作用提供了理论依据。     

Science Letters:Detection of Catabacter hongkongensis in polluted European water samples

The Catabacteriaceae is a new bacterial family with a unique member: Catabacter hongkongensis is a strictly anaerobic, non-sporulating, Gram-positive coccobacillus that is phylogenetically related to some clostridial clusters. Little is known of its epidemiology and environmental distribution, but the inclusion of its 16S rRNA gene sequence in GenBank has allowed it to be detected qualitatively. As a first approach for prospective surveys, a real-time polymerase chain reaction (PCR) procedure to identify C. hongkongensis has been developed. The presence of Catabacteriaceae in 29 water bodies subjected to possible human or animal impact has been investigated. Four of them were positive. The results confirm that highly polluted water can contain C. hongkongensis.     

猪圆环病毒Ⅱ型河南地方株ORF4的克隆及原核表达

根据GenBank数据库中猪圆环病毒Ⅱ型的基因组序列设计引物,采用PCR技术从病料基因组DNA中扩增出PCVⅡ河南地方株ORF4基因,全长180 bp,编码59个氨基酸.将该基因克隆至载体pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-ORF4表达载体.经PCR、酶切和测序鉴定后,转化表达菌株BL21（DE3）诱导表达.SDS-PAGE结果显示：ORF4能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为32 kD,且以包涵体形式存在.Western Blot检测结果显示,纯化后的ORF4蛋白能够与鼠抗6＆#215;His标签单克隆抗体发生特异性反应,为进一步研究PCVⅡORF4蛋白的特性与功能奠定了基础.     

Effectiveness of a Cloning and Sequencing Exercise on Student Learning with Subsequent Publication in the National Center for Biotechnology Information GenBank

With rapid advances in biotechnology and molecular biology, instructors are challenged to not only provide undergraduate students with hands-on experiences in these disciplines but also to engage them in the “real-world” scientific process. Two common topics covered in biotechnology or molecular biology courses are gene-cloning and bioinformatics, but to provide students with a continuous laboratory-based research experience in these techniques is difficult. To meet these challenges, we have partnered with Bio-Rad Laboratories in the development of the “Cloning and Sequencing Explorer Series,” which combines wet-lab experiences (e.g., DNA extraction, polymerase chain reaction, ligation, transformation, and restriction digestion) with bioinformatics analysis (e.g., evaluation of DNA sequence quality, sequence editing, Basic Local Alignment Search Tool searches, contig construction, intron identification, and six-frame translation) to produce a sequence publishable in the National Center for Biotechnology Information GenBank. This 6- to 8-wk project-based exercise focuses on a pivotal gene of glycolysis (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), in which students isolate, sequence, and characterize the gene from a plant species or cultivar not yet published in GenBank. Student achievement was evaluated using pre-, mid-, and final-test assessments, as well as with a survey to assess student perceptions. Student confidence with basic laboratory techniques and knowledge of bioinformatics tools were significantly increased upon completion of this hands-on exercise.     

Detection of Catabacter hongkongensis in polluted European water samples

The Catabacteriaceae is a new bacterial family with a unique member: Catabacter hongkongensis is a strictly anaerobic, non-sporulating, Gram-positive coccobacillus that is phylogenetically related to some clostridial clusters. Little is known of its epidemiology and environmental distribution, but the inclusion of its 16S rRNA gene sequence in GenBank has allowed it to be detected qualitatively. As a first approach for prospective surveys, a real-time polymerase chain reaction (PCR) procedure to identify C. hongkongensis has been developed. The presence of Catabacteriaceae in 29 water bodies subjected to possible human or animal impact has been investigated. Four of them were positive. The results confirm that highly polluted water can contain C. hongkongensis.     

Representative appressorium stage cDNA library of Magnaporthe grisea

A mature appressorium cDNA library of rice blast fungus, Magnaporthe grisea, was constructed in a λTriplEx2 vector by SMART?cDNA library containing 2.37×106 independent clones about 100% of which harbor foreign cDNA inserts with average size of 660 bp. Of 9 randomly