RNA干扰T细胞mTOR表达后诱导T细胞分化对小肠移植耐受的影响

目的:探讨RNA干扰T细胞mTOR表达后诱导T细胞分化对小肠移植免疫耐受的影响。方法:通过shRNA干扰T细胞mTOR表达后,诱导T细胞向Foxp3+Tregs细胞分化。对60只雄性SD大鼠施行30次异位节段小肠移植,随机分为A组(mTOR-shRNA转染组)、B组(mTOR抑制剂RAD001干预)和C组(移植对照组、注射生理盐水)。观察小肠移植后受体大鼠的体重变化、生存时间及移植小肠病理切片评估排斥反应程度。结果:构建的mTOR-shRNA质粒表达载体在体外能有效地抑制大鼠骨髓细胞mTOR基因mRNA和蛋白的表达。RNA干扰大鼠T细胞mTOR基因可调节T细胞的定向分化,Tregs细胞增多,而Th17细胞分化减少。抑制mTOR基因可诱导大鼠异位小肠移植的免疫耐受,减轻受体抗移植物的排斥反应,显著延长移植物的存活时间。结论:RNA干扰T细胞mTOR表达后诱导T细胞分化对小肠移植耐受的研究为mTOR抑制剂(RAD001)在移植后的临床应用提供理论和实验依据。     

人α-防御素-1在单核细胞内的表达及其基因克隆

目的:探测细胞氧化低密度脂蛋白(LDL)过程中人α-防御素-1(HNP-1)基因的表达水平并构建人HNP-1的克隆载体。方法:提取人单核细胞系(THP-1)的总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法获得cDNA,采用pBS-T克隆HNP-1。结果:用RT-PCR在THP-1细胞总RNA中扩增出一条285 bp的DNA片段,与HNP-1 cD-NA片段大小一致。重组质粒经PCR和测序鉴定获HNP-1基因克隆。另外,LDL可诱导THP-1细胞HNP-1的mR-NA表达增加。结论:HNP-1可能参与LDL的细胞氧化过程,成功构建HNP-1克隆载体将为进一步亚克隆到原核及真核的表达载体提供了基础。     

shRNA转基因猪中miRNA通路饱和引起的早期致死性(英文)

研究目的:通过制备抗猪瘟病毒shRNA转基因猪,探索shRNA对猪胎儿成纤维细胞、克隆猪早期胚胎发育以及转基因猪的影响。创新要点:基于稳定表达shRNA的猪胎儿成纤维克隆细胞及shRNA转基因克隆猪制备的结果,发现shRNA对克隆猪早期囊胚发育阶段无明显毒性,并首次报道了在shRNA转基因动物中,shRNA引起体内miRNA通路过饱和及动物致死性等毒性。研究方法:实验构建了多种抗猪瘟病毒shRNA表达载体,转染猪胎儿成纤维细胞并筛选得到细胞克隆,结合体细胞核移植技术制备了shRNA转基因猪。使用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测了细胞及个体水平siRNA的表达量、干扰素反应相关基因、内源miRNA及通路因子的表达量,同时检测了shRNA克隆细胞囊胚率。重要结论:shRNA能有效抑制猪瘟病毒的复制。在猪胎儿成纤维细胞水平上,稳定表达shRNA能引起细胞内干扰素反应、miRNA通路过饱和等副作用;在克隆猪发育阶段,shRNA对克隆猪早期囊胚发育阶段无明显毒性;在shRNA转基因克隆猪个体水平上,shRNA引起克隆猪体内miRNA通路过饱和及克隆猪早期易致死等毒性。     

素质教育舞蹈在高校公共体育舞蹈教学中的运用研究——以百色学院为例

目的:观察探讨C35在肝癌中的表达与靶向干预,为临床治疗提供依据。方法:设计两对C35编码区的si RNA并合成,构建到转录载体p TZU6+1上,形成重组质粒siRNA-C35,在脂质体介导下转染肝癌细胞株,RT-PCR分析RNA干扰后mRNA的变化,Western blot检测表达蛋白的变化。结果:扩增的目的基因条带亮度存在明显差异,与对照组相比,转染质粒pTZU6+1相对表达率为95.3%、siRNA1组相对表达率为40.0%,siRNA2组的相对表达率为28.4%。构建的重组质粒对C35mRNA的表达有抑制作用。只转染脂质体组和pTZU6+1的C35蛋白杂交带强于siRNA1和siRNA2,证实重组质粒可以抑制C35基因的表达,以对照组的蛋白带为标准,其图像分析可知,转染质粒pTZU6+1相对表达率为94.9%、siRNA1组相对表达率为29.6%,siRNA2组的相对表达率为32.2%。结论:通过设计C35基因敲除的si RNA可有效抑制C35基因的表达,肝癌细胞生长速度及侵袭性均发生改变,但C35基因在肝癌细胞株中及肝癌组织中低表达,不可作为肝癌的靶点干预基因。     

LL-37／hCAP-18基因克隆及其真核表达载体的构建

LL-37／hCAP-18是一种重要的多功能免疫分子、为探讨hCAP-18在基因治疗中的可行性，应用RT—PCR技术从人白血病细胞系J6—1细胞总RNA中成功扩增出560bp的hCAP-18基因编码区cDNA序列，构建了hCAP-18重组表达质粒phCAP-18．采用脂质体法将质粒phCAP-18瞬时转染COS-7细胞，Western blot证实，hCAP-18能在COS-7细胞中表达。     

RNA干扰及其应用综述

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的一种自然现象,是由双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默过程。在这一过程中,双链RNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),小干扰RNA与相关的蛋白质结合成RNA 诱导沉默复合体(siRNA-induced silencing complex,RISC),RISC识别并降解靶mRNA。现在认为RNA 干扰是真核生物共有的抗病毒、抗转座子、抗转基因和抗异常RNA的基因组免疫系统。随着RNA干扰的研究,产生了一种新的技术——RNA干扰技术,并得到了广泛的应用。     

重组大肠杆菌高效分泌表达α-1-6-葡聚糖酶

以pLF3为模板,PCR扩增得到葡聚糖酶的启动子,并将启动子基因重新连接到切除启动子基因及葡聚糖酶基因的pLF3载体上,构建pLF3-pro载体.采用PCR的方法扩增朱黄青霉总DNA中的α-1-6-葡聚糖酶基因,并插入到pLF3-pro载体上,构建pLF3-Pro-Dex质粒,以大肠杆菌DH5α为宿主菌,酶切验证及PCR验证均表明成功构建了pLF3-Pro-Dex质粒,且重组质粒中的α-1-6-葡聚糖酶基因与朱黄青霉中的α-1-6-葡聚糖酶基因有93%的同源性.     

水生植物凤眼莲Ca2＋-ATPase的原核表达与蛋白纯化

从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白．     

土豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及其活性包涵体分析

目的 克隆、表达土豆环氧化物水解酶基因,分析其活性包涵体.方法 提取土豆总RNA,以反转录获得的cDNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR),扩增得到土豆环氧化物水解酶基因,构建大肠杆菌表达质粒pET-REH,将重组表达质粒pET -REH转化E.coli BL21(DE3).结果 SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导表达的重组土豆环氧化物水解酶在各种温度下均主要以包涵体形式表达,只在15℃有微量可溶表达.酶活性分析表明,28℃表达的重组酶包涵体酶活性性为0.7 U/mg.结论 初步证实了存在活性包涵体的观点.     

人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

本实验旨在构建人核糖核酸酶抑制因子稳定干涉载体pLKO.1-ds RI,为后续观测人核糖核酸酶抑制因子干涉载体的表达对肿瘤细胞的影响奠定基础。用亚克隆法,将针对人核糖核酸酶抑制因子的干涉片段从Simple T-ds RI质粒克隆到pLK-0.1-TRC质粒,用酶切法筛选得到阳性重组质粒pLKO.1-ds RI,用测序法鉴定克隆序列正确。转染时设干扰组、空载体组和空白组三组,每组三次重复。用脂质体Cellfectin^R将pLKO.1-ds RI(干扰组)、pLKO.1-TRC(空载体组)转染进人肝癌细胞HepG2细胞中,未处理的细胞作空白组。转染后72hr用Western blotting检测细胞中核糖核酸酶抑制因子表达的变化。双酶切鉴定及测序鉴定结果均正确;Western blotting结果表明,对比空白组(1.1578±0.015)和空载体组(1.1216±0.027),干扰组RI表达(0.6119±0.048)明显下调(P<0.05)。结果表明人核糖核酸酶抑制因子干涉载体pLKO.1-ds RNH1构建成功。