棒状杆菌表达载体的构建

ｐＧＡ４６－４是一个带有谷氨酸棒杆菌妄动功能片断的质粒。用ＰＣＲ技术从ｐｇａ４６－４中扩增该启动子片断，将该启动子Ｔ４噬菌体Ｐ３２基因的终止子克隆到大肠杆菌质粒ｐＫ１８上，再接入棒状杆菌粒ｐＸＺ１０１４２构建一穿梭表达载体。     

一种地衣芽孢杆菌表达载体的构建

用PCR方法从地衣芽孢杆菌WH-08基因组DNA中分别扩增α-淀粉酶基因amyL启动子PamyL和终止子TT,用重叠PCR技术将两者连接,重叠PCR产物用Hind III和EcoR I双酶切后,与经相同酶切的载体PHY300 PLK连接,构建重组质粒PHY-PamyL-TT。该重组载体的构建为外源蛋白在地衣芽孢杆菌中的高效表达奠定了基础。     

猪干扰素基因的克隆与原核表达载体的构建

干扰素(Interferon)是一种广谱抗病毒剂,具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种作用而被广泛应用于病毒性疾病的预防和治疗。本实验以猪肝脏组织为材料,提取猪肝脏组织DNA,根据Gen Bank收录的猪干扰素基因序列设计特异性引物,以猪肝脏DNA为模板进行高保真扩增得到IFN基因的ORF片段,然后进行了T载体克隆。再利用引入Eco RⅠ、SalⅠ酶切位点的特异性引物对IFN成熟肽段的基因进行亚克隆,经双酶切、连接、转化后,成功构建了p ET28a-ifn原核表达重组质粒,为干扰素基因的原核表达奠定了基础。     

植物基因工程研究进展 --目的基因的克隆与载体构建

20世纪80年代以来．基因工程技术在农业上的应用取得了斐然成果，植物基因工程已成为农业绿色革命的最重要技术手段，为此对植物基因工程中目的基固的克隆，载体构建的研究进展作了综合评述．     

简并PCR法克隆L.starkeyi苹果酸酶基因

根据已报道的酵母苹果酸酶基因序列,利用CodeHop（Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）软件设计两对简并引物,以斯达油脂酵母（L.starkeyi CICC 1809）总DNA为模板做简并PCR,得到2个基因片段（ME1,ME2）.对这2个目的片段进行测序,将结果翻译成氨基酸序列,blastp结果显示其中ME2片段为油脂酵母未报道苹果酸酶基因的序列（Gene Bank登录号GU348991）,并对巢式PCR方法检验简并PCR结果的有效性进行了评估.     

核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及hpRNAi载体的构建

多聚半乳糖醛酸酶是核盘菌致病力发挥作用的关键酶。本研究用PCR的方法从核盘菌基因组DNA中扩增出多聚半乳糖醛酸酶（PG5）基因片段,再以扩增出的PG5基因片段作为模板设计引物扩增出一个相应较小的片段。将两个PG5基因片段反向插入到植物表达载体2300 sn的35S启动子和nos终止子之间,构建出可转录表达出发夹RNA结构的组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰抗菌核病的基因工程研究奠定了基础。     

IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达

对造血调控中发挥重要作用的IKAROS基因亚型IK4进行突变,并构建重组逆转录病毒表达载体及使其在白血病细胞中表达。采用重叠延伸PCR定点突变技术,成功构建了4个IK4单突变或多突变突变体。将这4个突变体克隆至Pmscvpuro逆转录病毒载体中,构建重组蛋白表达载体。基因测序验证突变序列正确后,将重组逆转录病毒载体与病毒包装质粒VSVG、Gag-Pol共同感染293T细胞,过滤收集病毒上清,将病毒上清转染白血病NB4细胞。用Puromycin对细胞进行筛选,并通过Western印迹法对突变体表达细胞系进行验证。通过重叠延伸PCR法成功构建了4个IK4的定点单突变和定点多突变体,利用逆转录病毒介导的转染方法使IK4的4个突变体在白血病细胞中成功稳定表达,为后续的功能和机制的研究奠定了基础。     

日本对虾β-actin基因的克隆表达与纯化

利用RT-PCR技术从日本对虾中克隆到β-actin基因的cDNA,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得阳性克隆.4℃下IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得高纯度的β-actin蛋白.①     

基因表达载体构建实验的拓展

在传统的双酶切方法基础上,利用同源重组原理同样可以将目的 基因连接在载体上,并且该方法可将目的 基因插入到载体上的任一位点,这极大地提高了载体的构建效率,也有利于学生对基因工程的进一步理解.     

活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR标准品制备方法的比较

为了快速准确地检测活性污泥中氨氧化菌(AOB)的拷贝数,探求一种新的快速简便的绝对定量标准品的制备方法。利用纯化的PCR产物和重组质粒标准品分别进行绝对定量,比较两者熔解曲线、扩增曲线、标准曲线和绝对拷贝数等方面的差异,分析两种标准品制备方法应用方面的优势。结果显示,两种标准品制备的熔解曲线都呈单一尖峰、扩增曲线指数期平行、标准曲线R299%,PCR产物作为标准品得到的AOB绝对拷贝数小于质粒标准品的结果(P0.05),表明纯化的PCR产物作为标准品较制备重组质粒标准品而言,操作过程更加简便、经济、对人员专业要求更低,在其纯度较高的情况下,具有和重组质粒标准品一样的应用效果。     

乳液PCR扩增复杂基因序列的方法建立及普通PCR的比较

该研究分析普通PCR的不足,通过较多实验研究初步建立乳液PCR方法,改善PCR实验技术.采用人工合成的乳酸杆菌质粒为模板,不同成分配比条件下的乳液PCR和普通PCR对质粒序列进行扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后对凝胶进行Gelred染色并用GS-800灰度扫描仪成像.进一步分析乳液PCR和普通PCR扩增产物的特异性以及不同成分配比条件下乳液PCR的扩增质量.通过比较两种PCR方法的扩增结果可得,在相同条件下,乳液PCR扩增特异性高于普通PCR扩增,并确定当水相中加入100 g/L BSA,水油体积比在1∶2.5时,破乳水饱和乙醚体积比为1∶1时,水油相在1700 rpm条件下连续混合5 min时扩增效果最好.     

斑节对虾白斑综合症杆状病毒检测方法及其应用

对白斑和红体带白斑斑节对虾光镜和电镜观察，对虾白斑综合症杆状病毒（WSBV）感染外胚层和中胚层组织器官．应用WSBVPCR检测技术证实一种WSBV感染鳃、甲壳表皮、神经和肌肉，在肝胰腺、消化管（含胃）、心脏和血液中未检测到，其结果与组织学观察有出入．PCR检测WSBV最佳取材部位是对虾甲壳表皮和肌肉．PCR方法可应用于WSBV的提纯，实验用健康虾的筛选，实验感染WSBV的跟踪，以及流行病学研究．通过PCR方法和电镜观察结合证实红体病斑节对虾（不带白斑者）不是WSBV所致，修正了前人的观点．     

试论我国成品油零售网络构建的战略分析

在当前的成品油销售业竞争中,市场全球化、需求顾客化、变化常态化等已成为现代成品油销售企业市场竞争的基本特征.随着经济的高速增长以及中国汽车产业的快速壮大,其销售网络正呈现出扩张趋势,竞争日趋激烈的国内成品油销售市场对销售企业的网络构建提出了严峻挑战.为构造这一核心竞争能力,成品油销售企业必须尽快构建起科学有效的零售网络体系,并在实践中不断加以完善,以持续地提高成品油企业经营业绩与综合竞争力.     

浅析产品质量责任

随着我国经济建设的蓬勃发展,一方面丰富多样的物质产品使人民的物质生活所需得到极大地满足,另一方面由于利益驱动,假冒伪劣产品充斥市场,极大地危害了消费者的合法权益,因产品质量责任提起的诉讼不断上升.本文从产品质量责任的两个重要界限出发,对产品质量责任进行论述,以便确定责任人的责任范围和承担责任的方式,切实保护消费者的合法权益.     

多学科高度融合的电子产品交互设计教材建设的探索

复合交叉人才培养一直是各个高校十分重视的研究课题,但鲜有高校探索如何从思维方式上培养多学科高度融合的复合交叉人才。浙江大学城市学院把电子信息工程系定位于电子产品交互设计的特色专业方向,旨在培养该方向的复合交叉人才。文章以电子产品设计基础教材建设为例,提出了多学科高度融合教材建设的必要性,探讨了如何发挥电子信息学的优势,体现了多学科间内容的高度融合及创新思维的培养,提出了多学科高度融合教材的建设思路,最后对其使用效果进行了评估。     

河南省农产品物流体系构建对策研究

近年来河南省现代农业建设取得新进展,但农产品物流系统不完善,出现了农产品“卖难”和“买难”共存的现象.针对河南省农产品加工处理程度低、流通效率低、生产组织水平低、基础设施落后等问题,借鉴国内外经验,提出构建基于供应链的农产品物流体系,发展多元化农村市场流通主体等对策.     

具有毒性质粒沙门菌荧光PCR快速检测试剂盒的研发

介绍了用于检测具有毒性质粒沙门菌的2种荧光PCR试剂盒（一种是荧光PCR染料法检测试剂盒,另一种是荧光PCR探针法检测试剂盒）的研制过程,2种试剂盒运用了自行设计的特异性引物和TaqMan探针,能同时特异性地从众多的沙门氏菌和非沙门氏菌中高效、快速、准确地检测出多种具有毒性质粒沙门氏菌,而对于不具有毒性质粒的沙门氏菌和非沙门氏菌均不能检出,可为食品检验和医疗诊断领域提供方便快捷检测具有毒素质粒沙门氏菌的荧光PCR试剂盒．     

创新农村金融产品 助推新农村建设

农村金融产品创新对新农村建设具有重要的意义。现阶段农村金融产品创新由于人们认识不足、体制弊端、金融产品结构不完善、诚信缺乏、金融监管不严等原因,造成了农村金融产品单一、灵活性差、不适应新农村建设的发展。为此,各金融机构要改变观念、改善信贷管理体制、培育多元化的农村金融产品结构、完善农村信用体系、加强监管。大力创新农村金融产品,包括抵押形式创新、担保机制创新、风险机制创新、保证贷款创新、信用贷款创新等。     

海南旅游商品存在的问题及其发展建议

人们传统上对旅游商品的认识是"重有形、轻无形",文章以海南为例,主张"有形和无形并重"对旅游商品的概念作了延伸和扩展。分析海南旅游商品的发展现状,结合海南旅游商品的特点,提出海南发展旅游商品的一些新思路,指出海南旅游商品必须在开发、生产、销售、服务等环节,全方位创新经营理念,从而提高国际旅游岛旅游商品的影响力。     

《PCR技术》双语教学的调查与分析

为了探讨有效的双语教学方法,文章对大学三年级学生学习《PCR技术》双语课程的教学现状进行了调查,该调查结果对指导《PCR技术》双语教学有重要意义。