破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的：制备并鉴定破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,为破伤风的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法：用破伤风类毒素做抗原免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度针对破伤风类毒素的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接ELISA和Western-blot检测单克隆细胞株的特异性。结果：通过细胞融合和克隆化,筛选出3株持续分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E12、1E11、1G10。间接ELISA和Western-blot检测结果表明1E12、1E11、1G10可以和破伤风类毒素发生特异性反应。结论：成功制备了抗破伤风类毒素单克隆抗体,为制备免疫诊断试剂盒和抗体药物的开发奠定了基础。     

抗原-弗氏佐剂乳化实验技术的改进与技巧

介绍了一种抗原-弗氏佐剂乳化方法和操作技巧,并验证其实验效果。以自制电动佐剂搅拌器和注射器协同乳化BSA-弗氏佐剂混合物,滴水实验和离心实验检测乳化效果。电动佐剂搅拌器和注射器协同乳化法可在5～10 min内快速乳化抗原,乳化物在水中呈不扩散的油包水状;乳化液以5 000r/min离心5min,未见分层现象。与传统乳化方法相比,电动佐剂搅拌器和注射器协同乳化法具有乳化速度快、效率高、不浪费抗原、免疫效果好等特点,值得推广使用。     

分泌抗猪囊尾蚴McAb杂交瘤细胞株的建立

为了对囊尾蚴病的免疫诊断提供有价值的单克隆抗体(McAb),我们应用杂交瘤技术通过对骨髓瘤细胞SP2/0与用猪囊尾蚴尿素溶性抗原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合试验及反复筛选和多次克隆化,获得了两株分泌抗猪囊尾蚴抗原的McAb杂交瘤细胞株2D_6、4F_(12)。其分泌的抗体具有很强的种的特异性,与包虫囊液抗原及肥颈绦虫囊尾蚴抗原均不发生交叉反应。免疫球蛋白亚类鉴定表明所获2株均属IgG。     

膝沟藻毒素GTX2,3完全抗原的HPLC及免疫学鉴定

通过醛化法将膝沟藻毒素(GTX2,3)分别与血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联制备完全抗原,高效液相色谱法(HPLC)检测醛化反应前后游离GTX2,3的浓度,完全抗原免疫Balb/C小鼠,间接酶免疫吸附试验检测免疫后血清中抗体效价。GTX2,3与KLH及BSA偶联反应前溶液中毒素的浓度分别为760μg·mL-1和660μg·mL-1,偶联反应后毒素的浓度分别为191μg·mL-1及256μg·mL-1,Balb/C小鼠经过5次免疫后血清的效价为1：500。结果表明,反应后游离的GTX2,3的浓度降低,制备的GTX2,3完全抗原免疫小鼠后小鼠产生抗GTX2,3抗体,说明GTX2,3与载体蛋白发生偶联反应,偶联物具有免疫原性。     

抗重金属镉离子鼠源性多克隆抗体的制备与鉴定

制备并鉴定针对重金属镉离子的小鼠多克隆抗体.选取异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)做金属螯合剂,偶联Cd~(2+)及载体蛋白BSA、OVA,制备人工抗原并鉴定,配合佐剂乳化后以高、中、低剂量分别免疫Balb/C小鼠,以获得较好的抗重金属镉离子小鼠多克隆抗体血清.采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定所获抗体的效价、敏感度、特异性.结果显示:小鼠抗血清效价均在10~(-3)～10~(-4),中剂量抗原免疫组小鼠抗体血清更加稳定、特异性强,利用该组多抗建立间接竞争ELISA(icELISA)标准曲线,M-3号小鼠敏感性最强,回归方程为y=0.1123x-0.1638,IC_(50)质量浓度为368.70μg/L,检测限质量浓度为25.53μg/L,该抗体除与汞离子螯合物的交叉反应率为72.58%之外,与Cu~(2+)、Zn~(2+)、Pb~(2+)、Cr~(3+)、Mo~(6+)、Fe~(3+)、Co~(2+)均无交叉反应.获得了能用于镉离子免疫检测的高效价Cd~(2+)多抗,为检测产品的开发打下基础.     

关于单克隆技术理解上的几个偏差及纠正

1975年,克勒和尔斯坦发现,将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增值,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。他们因此获得1984年的诺贝尔医学或生理学奖。制备单克隆抗体的过程要包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗     

单克隆抗体的制备

单克隆抗体指来自一个Ｂ淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的、针对同一抗原决定簇的抗体。１９７５年，英国剑桥医学研究理事会（ＭＲＣ）分子生物学实验室的两位免疫学家——Ｇｅｏｒｇｅｓ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ设计了经典的制备单克隆抗体技术，并因此获得了１９８４年的诺贝尔生理学或医学奖。基本的过程包括给小鼠注射一种抗原，它可以被免疫系统识别，因此诱导小鼠的Ｂ淋巴细胞产生相应抗体。然后，在培养基中融合小鼠的Ｂ淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞，产生杂交瘤细胞，经过筛选分离出单个杂交瘤细胞，再使单个杂交瘤细胞扩增，最后分离…     

基于单克隆抗体的检测马铃薯植物中马铃薯S病毒的血清学方法（英文）

目的:建立基于单克隆抗体的检测马铃薯植物中马铃薯S病毒(PVS)的血清学方法,为我国PVS的田间调查和检测及无毒种薯的生产提供快速、实用的检测技术。创新点:首次制备了抗PVS的高度特异和灵敏的单克隆抗体,并以制备单抗为核心建立三种能快速、准确、灵敏、特异地检测PVS的血清学检测方法。方法:以差速离心方法提纯的PVS病毒粒子作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了能稳定传代并分泌PVS单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩繁的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔获得单抗腹水,并以纯化的制备单抗为核心,根据血清学原理建立检测马铃薯植物中PVS的双抗夹心酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)和组织印迹酶联免疫吸附试验(tissue print-ELISA)血清学检测方法;并对田间马铃薯样品进行PVS检测,分析建立的血清学方法检测PVS的有效性。结论:利用杂交瘤技术获得了五株能稳定传代并分泌PVS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以制备杂交瘤细胞分泌的单抗为核心建立了检测马铃薯植株中PVS的DAS-ELISA、dot-ELISA和tissue print-ELISA三种血清学方法。三种血清学方法检测感染PVS的马铃薯植株呈阳性反应,而检测健康的马铃薯及感染其他三种马铃薯病毒的植株呈阴性反应,且建立的DAS-ELISA和dot-ELISA方法检测马铃薯病叶的灵敏度分别达到1:163 840和1:10 240倍稀释(w/v,g/ml)。田间样品检测结果发现,建立的血清学方法的检测结果与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的检测结果一致,表明建立的血清学方法可有效地用于马铃薯植物中PVS的检测,从而为我国PVS的田间调查和检测及无毒种薯的生产提供快速、实用的检测技术。     

凤果花叶病毒高灵敏度血清学检测技术（英文）

目的:建立基于单克隆抗体的检测番茄等植物中凤果花叶病毒(Pep MV)的血清学方法,为Pep MV的田间调查和诊断及其科学防控提供快速实用的检测技术。创新点:首次制备了抗Pep MV的高度特异和灵敏的单克隆抗体,并利用制备的单抗建立了3种能特异且灵敏地检测Pep MV的血清学方法。方法:以差速离心方法提纯的Pep MV粒子作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了能稳定传代并分泌Pep MV单克隆抗体的杂交瘤细胞株;杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔获得单克隆抗体腹水,并以制备单抗为核心,根据血清学原理建立检测植物中Pep MV的双抗夹心酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)和组织印迹酶联免疫吸附试验(Tissue print-ELISA)三种血清学检测方法;利用田间番茄样品分析建立的血清学方法检测Pep MV的有效性。结论:利用杂交瘤技术获得了6株能分泌高度特异灵敏Pep MV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以分泌的单抗为核心建立了检测植株中Pep MV的DASELISA、Dot-ELISA和Tissue print-ELISA三种高度灵敏的血清学新技术。三种建立的血清学技术检测感染Pep MV的番茄植株均呈强阳性反应,而检测健康番茄及感染其他5种植物病毒的植株呈阴性反应,且DAS-ELISA和Dot-ELISA血清学技术检测番茄病叶粗提液的灵敏度分别达到1:1 310 720和1:20 480倍稀释(质量体积比,g/m L)。田间样品检测结果发现,建立的血清学技术的检测结果与反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的检测结果一致,表明建立的血清学方法可有效地用于植物中Pep MV的检测。同时,本研究首次发现Pep MV已在我国云南番茄作物上发生流行。Pep MV单克隆抗体的制备及其灵敏血清学检测方法的建立有益于Pep MV的田间调查和诊断及其科学防控。     

LAK细胞疫苗治疗大鼠佐剂关节炎的初步探讨

目的为探索RA生物治疗的新途径,以及进一步认识RA的发病机制方法：近交系SD大鼠以完全弗氏佐剂致炎形成佐剂关节炎（adjuvantarthritis,AA）．分离AA大鼠淋巴细胞,经培养扩增后,采用已建立的肿瘤疫苗专利技术制成LAK疫苗．实验动物分别于腋下注射LAK细胞疫苗,每周一次共2次．治疗前后分别采血测定WBC和RBC并作比较分析结果经LAK细胞疫苗免疫后,实验动物组外周血淋巴细胞数目较治疗前显著减少（23.75±9．36对10.82±6,38,p＜0.01）．同时实验动物组的贫血状况明显好转,RBC数量明显增加（6.40±1.67对9.24±2．21,P＜0．05）结论LAK细胞疫苗可降低佐剂关节炎外周血淋巴细胞的数目并改善其贫血状态,在治疗自身免疫性疾病中可能是一种有用的手段,值得进一步研究．     

胶原诱导型大鼠类风湿关节炎模型的实验研究

目的：探讨大鼠类风湿性关节炎（RA）动物模型的制备、病理组织学观察及血清细胞因子IL-1、TNF-α检测。方法：以实验大鼠为对象,Ⅱ型胶原（CII）和完全弗氏佐剂（Complete Freund＇s Adjuvant,CFA）混合注射,不同时间点实验组大鼠（O、7、14、28、42d）所获得血样用于做IL-1、TNF-α检测,膝关节标本进行组织病理学研究。结果：模型组血清IL-1、TNF-α在急性期增高明显,与对照组差异有统计学意义（P〈0.05）。模型组关节组织标本观察到滑膜组织增生,其局部骨吸收破坏明显,软骨表层胶原纤维溶解、软骨细胞变性坏死,软骨表面凹凸不平。结论：采用异种CII与CFA制备的RA模型,可以用于RA组织病理学、发病机理及治疗方面的研究。     

抗人双特异性磷酸酶DUSP18单克隆抗体的制备及鉴定

双特异性磷酸酶（Dual Specificity Phosphatase）是酪氨酸磷酸酶家族中的一员,这个家族中的成员既能对磷酸化酪氨酸去磷酸化,也能对磷酸化丝／苏氨酸去磷酸化．此外,它们还在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径（MAPK）中起重要生理功能．为了制备抗人双特异性磷酸酶的单克隆抗体（mAb）,以DUSP18重组蛋白为抗原免疫BALB／e小鼠,通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗相应磷酸酶的mAb．用Western blot检测mAb对重组蛋白和细胞中天然磷酸酶的反应性,共获得6株可稳定分泌抗磷酸酶mAb的杂交瘤细胞株,为进一步研究双特异性磷酸酶的去磷酸化作用机理以及其在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径（MAPK）中的信号转导提供强有力的工具．     

抗土霉素单克隆抗体的制备及其在虾中土霉素残留的检测应用(英文)

研究目的:抗土霉素单克隆抗体的制备和特性分析,并用于间接竞争酶联免疫吸附测定法(icELISA)分析虾样品中土霉素的残留。创新要点:本研究建立分泌抗土霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,筛选出对虾中土霉素残留检测具有较高灵敏度的单克隆抗体2-4F。研究方法:用细胞杂交技术使土霉素-牛血清白蛋白偶联物免疫的BALC/c雌性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立三株分泌抗土霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2-4F、7-3G和11-11A),并制备它们的单克隆抗体。通过icELISA法分析单克隆抗体对土霉素的半抑制质量浓度(IC50)和交叉反应率,明确其灵敏度和特异性。重要结论:实验结果发现单克隆抗体2-4F具有最高的灵敏度,对土霉素的IC50为7.01 ng/ml,且该单抗特异性强,仅与罗利环素之间有强烈的交叉反应,而与非相关抗生素不发生交叉反应。当利用单克隆抗体2-4F检测虾样品中的土霉素含量时,其批内和批间回收率分别为82%~118%和96%~113%,变异系数分别为3.9%~13.9%和5.5%~14.9%。因此,单克隆抗体2-4F可用于虾产品中土霉素残留分析试剂盒的开发。     

氯睾酮人工抗原的合成与鉴定

采用琥珀酸酐法将氯睾酮(CLO)衍生化,再用碳二亚胺法(EDC)将氯睾酮的半抗原与BSA和OVA偶联,制备免疫原和检测抗原,紫外扫描和红外光谱鉴定表明人工抗原合成成功,CLO与BSA偶联比为16.5∶1.利用CLO-BSA免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗血清,间接ELISA结果表明:3只小鼠抗体效价分别为1.6×104、3.2×104和1.6×104;间接竞争ELISA检测2号鼠抗血清的灵敏度为64 ng/mL.氯睾酮人工抗原的合成为开发ELISA试剂盒检测食源性动物产品中CLO残留奠定基础.     

“缓凝型水溶性聚氨酯的合成及在油田堵水的应用研究”项目简介

<正>"缓凝型水溶性聚氨酯的合成及在油田堵水的应用研究"是唐山学院张建生老师主持的唐山市科学技术研究与发展计划项目。该项目是针对我国油田中后期石油采收率低,含水量而研制的一种高分子聚合物。采用新型聚合技术制备高性能产品,其特     

赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮二联定量胶体金免疫层析试纸条的制备及应用（英文）

目的:优化建立二联胶体金免疫层析试纸条,实现对玉米、面粉和饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的同时快速定量检测。创新点:采用纳米金颗粒标记真菌毒素单克隆抗体,基于竞争反应模式,通过对金颗粒尺寸、免疫层析相关组成材料及缓冲液配方的系列优化,同时借助手持式信号读取装备,实现对谷物和饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的同时定量检测。该方法简单、快速且成本低,与液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)一致性良好,便于基层单位的推广使用。方法:采用柠檬酸钠还原法制备纳米金颗粒并标记获得金标抗体。通过在基于竞争反应的免疫层析检测体系中,同时设置两条检测线(T1、T2)以实现两种毒素的同时检测,最终采用金标信号读数仪实现定量检测。结论:制备的二联定量胶体金试纸条对赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的检测限分别为0.32和0.58 ng/ml(图5),在玉米、小麦和饲料样本中的加标回收率为77.3%～106.3%,且变异系数均小于15%(表2)。制备的二联定量胶体金免疫层析试纸条和LC-MS/MS对玉米、小麦和饲料等天然样本中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的定量检测结果相关性较好(表3和图7),具有较好的应用价值。     

LAK细胞疫苗对大鼠佐剂关节炎淋巴细胞及其亚群的影响

目的：为进一步探索ＬＡＮ细胞疫苗在ＡＡ大鼠治疗中的作用．方法：近交系ＳＤ 大鼠以完全弗氏佐剂致炎形成佐剂关节炎（adjuvant arthritis,AA）．分离ＡＡ大鼠淋巴细 胞,经培养扩增后,采用已建立的肿瘤疫苗专利技术制成ＬＡＫ细胞疫苗．实验动物分别 于腋下注射ＬＡＫ细胞疫苗,每５日一次共３次．治疗前及治疗后一周分别采外周血测定 Ｔ细胞亚群,同时行外周血涂片和骨髓细胞学检查．结果：经ＬＡＫ细胞疫苗免疫后,ＡＡ 实验动物组外周血淋巴细胞百分率较对照组降低（Ｐ＜０.０１）,Ｔ细胞亚群ＣＤ８＋较对照组明 显上升（Ｐ＜０．０５）,ＣＤ４／ＣＤ８比值下降,两组差别具有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。结论： ＬＡＫ细胞疫苗可有效地降低佐剂关节炎大鼠外周血淋巴细胞的数目并提高ＣＤ８＋Ｔ细胞 亚群的数量,在治疗自身免疫性疾病中可能是一种有用的手段,值得进一步研究．     

基于vasohibin的免疫脂质体的制备及鉴定

目的 制备并鉴定基于vasohibin质粒的免疫脂质体,为抗肺纤维化的治疗提供理想的载体工具.方法 采用逆相蒸发法,首先制备含vasohibin质粒的脂质体,并与山羊抗小鼠VWF单克隆抗体相连,形成免疫脂质体,并对其形态结构、粒径进行检测.结果 研究结果证明本实验成功构建含vasohibn质粒的免疫脂质体,所获得的免疫脂质体能形成平均粒径为50-100 nm的球形颗粒.结论 本实验成功地制备了基于vasohibin的免疫脂质体,为体内的进一步应用于抗肺纤维化的治疗打下了基础.     

丹参7种水溶性有效成分配伍对脑缺血再灌注所致记忆损伤模型小鼠的影响

目的：探讨前期研究筛选出的丹参七种水溶性有效成分最优配伍组合样品A2、B4、C11对脑缺血再灌注（ischemia reperfusion）小鼠学习记忆的保护作用。方法：采用改进的Himori法暂时性阻断两侧颈总动脉制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用水迷宫实验,观察配伍组合样品对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用,检测小鼠断头耐缺氧存活时间,脑组织中超氧化物歧化酶（superoxi dedismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、乙酰胆碱酯酶（aeetyleholine esterase,ACHE）活力及丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。免疫组织化学方法检测小鼠海马神经元凋亡相关天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine-asparate protease-3,caspase-3）和神经生长因子（nerve growth factor,NGF）的表达。结果：丹参7种水溶性有效成分配伍组合样品B4、C1l可明显改善小鼠脑缺血再灌注所致的记忆障碍,增强耐缺氧能力,提高脑内SOD,CAT活性,降低AChE活性和MDA含量;抑制凋亡蛋白caspase．3表达,上调NGF表达。其中以B4（2．8μm01·L-1）、C11（30．0iμmol·L-1）组作用最为明显（P〈0．01）,A2各个剂量组效果不显著（P〉0．05）。结论：丹参7种水溶性有效成分配伍组合样品B4、C11对脑缺血再灌注损伤小鼠记忆功能有保护作用,其机制可能通过提高清除脑内自由基能力,抑制小鼠神经细胞凋亡,促进神经再生,来减轻脑缺血再灌注引起的脑组织损伤。     

酸性离子液体催化双香豆素的合成研究

采用新型的布朗斯特酸性离子液体催化了香豆素与芳香醛的缩合反应,在水溶剂中以良好的收率制备了13种双香豆素化合物。所用催化剂易于制备和存储,重复使用能保持较高的催化活性。