真核生物表达系统研究进展

从毕赤酵母表达宿主菌，表达载体，外源蛋白在毕赤酵母中的表达，毕赤酵母表达系统的优化和丝状真菌的转化，CBH表达系统及rDNA整合序列等方面综述了近年来关于毕赤酵母和丝状真菌表达系统的研究进展．     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是应用较为成功的外源蛋白表达系统之一,它具有真核生物表达系统的特点,能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工,至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达.本文综述了毕赤酵母表达系统的一些特点和优势、毕赤酵母表达载体组成和外源蛋白在毕赤酵母中表达的过程.     

重组毕赤酵母培养基碳源的选择

目的：对毕赤酵母重组菌GS115-Ch—Glu菌种进行发酵脱毒条件的优化,为大规模发酵重组毕赤酵母获得高表达目的蛋白奠定基础。方法：以毕赤酵母重组菌为实验菌株,分别以葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、蛋白胨、甘油、玉米淀粉＋甘油为碳源,研究不同碳源对菌株细胞生长的影响。结果：毕赤酵母重组菌的最适碳源为玉米淀粉,最适浓度为2．5％。     

蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达

将蚓激酶基因克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达裁体pPICgk-lum3.将其线性化后转化毕赤酵母GS115,挑选Muts型毕赤酵每转化子,经甲醇诱导表达,纤维平板法检测其上清液纤溶酶活性最大为80U/mL.     

毕赤酵母直接基因敲除方法的研究

甲醇营养型巴斯德毕赤酵母已被广泛应用于外源蛋白的表达,但是作为一个外源蛋白表达系统,其还有待进一步完善。进一步提高外源蛋白的表达量以及形成折叠正确的目的蛋白,成为了改造毕赤酵母菌株的一个热点。基因缺失,是一个常用的改造和构建新的毕赤酵母重组菌株常用的方法。巴斯德毕赤酵母直接基因缺失方法主要分为两类:有标记的插入替换和无标记的Pop-In/Pop-Out。本文系统地介绍了这两种方法,分别比较了各自的优缺点,为它们在巴斯德毕赤酵母中进行基因敲除提供了一定参考意义。     

毕赤酵母表达系统中启动元件的研究进展

毕赤酵母是真核细胞常用表达系统之一,具有细胞密度高、纯化方法简单、转录后修饰功能完善等优点.作为重要的调控元件,表达系统中启动元件的功能强弱与表达效率的高低密切相关.目前,毕赤酵母表达系统中常用的启动元件分为三类,分别是以p A OX为代表的甲醇诱导型、以pGAP为代表的非甲醇诱导型,还有一些新型工业酵母启动子也是理想的表达系统启动元件.充分了解这些酵母启动子的最新研究进展,可以为工业酵母表达系统的优化提供重要的发展思路.     

拟穴青蟹抗菌肽scygonadin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

采用PCR方法克隆获得拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因成熟肽片段,将其连接到Pichia pastoris酵母表达载体pPIC9K中,构建了分泌表达载体pPICgk-Scy．电击转化毕赤酵母GS115,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合人酵母基因组中．以甲醇诱导表达阳性克隆,上清中表达产物经过Tricine-SDS-PAGE鉴定与预期的目的蛋白大小（约10ku）相符．并利用琼脂孔穴扩散法证明了表达产物能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长．     

24孔板培养毕赤酵母GYW-1合成谷胱甘肽条件的优化

为了优化24孔板培养毕赤酵母GYW-1合成谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的发酵条件,本文采用单因素实验和正交试验对24孔板的发酵条件进行优化.结果表明,毕赤酵母GYW-1 24孔板发酵产GSH的最优发酵条件为:酵母粉44 g/L、柠檬酸铵15 g/L、接种量12%.通过对发酵条件的优化,可以明显提高毕赤酵母GYW-124孔板发酵产GSH的产量(43.815 mg/L),较初始条件的产量增加了55%.     

不同碳源对重组毕赤酵母表达嗜热β-半乳糖苷酶的影响

为分析碳源对嗜热β-半乳糖苷酶在组成型重组毕赤酵母中的表达水平,葡萄糖、果糖、丙三醇、乳糖、蔗糖和麦芽糖分别用于配制培养基的碳源.当以单糖和甘油为碳源时,酵母的生长和重组嗜热β-半乳糖苷酶的分泌水平要优于双糖;以果糖为碳源时,重组酵母分泌嗜热β-半乳糖苷酶的水平最高,其次为葡萄糖和丙三醇,蔗糖要高于麦芽糖,乳糖最低.     

户太八号葡萄酒发酵过程中菌群种类研究

本研究对西安地区特有葡萄品种——户太八号在自然发酵酿制葡萄酒的不同时期分离出的酵母菌种类进行研究。利用WL营养琼脂培养基,对分离出的339株酵母菌进行初步鉴定。结果表明,在发酵前期,分离出的酵母菌数量最少,种类最多,可归入6个属8个种,即葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母、美极梅奇酵母、膜璞毕赤酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、酿酒酵母、毕赤克鲁维酵母及红冬孢酵母,分别占发酵前期酵母菌总数的48.8%,20.9%,11.6%,7.0%,4.7%,2.3%,2.3%和2.3%;在发酵中期,分离出的酵母菌种类仅有4种,即酿酒酵母、东方伊萨酵母、毕赤克鲁维酵母及葡萄汁有孢汉逊酵母,分别占发酵中期酵母菌总数的67.1%,26.0%,5.5%和1.4%;而发酵末期,只有酿酒酵母。户太八号在自然发酵酿制葡萄酒的不同时期菌群种类不尽相同,为户太八号葡萄酒发酵过程中菌群种类动态变化的研究及优势菌种的筛选奠定了基础。     

毕赤酵母发酵过程胞内活性氧的定量分析

利用流式细胞术对毕赤酵母发酵过程中胞内活性氧（ROS）的变化进行定量检测和分析,建立发酵过程单位细胞胞内ROS的相对含量以及单位体积细胞胞内ROS相对含量的计算方法,分析ROS积累对毕赤酵母细胞活力的影响,研究结果表明：在甲醇流加阶段,单位细胞的DCF（2′,7′-二氯荧光黄）染色平均荧光强度随着时间的增加而增加,即单位细胞胞内ROS的含量在甲醇流加阶段一直增加,细胞内产生持续的氧化压力,导致部分细胞死亡;单位体积酵母细胞的胞内ROS含量在甲醇流加阶段保持在一个相对稳定的范围。     

植酸酶产生菌的筛选及产酶动态初探

用平皿培养法根据植酸钙溶解圈的有无从34种已知菌种中得到28株菌在0．1％植酸钙平板分离培养基上有明显的透明圈（占已知菌的82．4％），从中选黑曲霉，白地霉，毕赤酵母，酿酒酵母四株在0．1％植酸钙为唯一磷源的合成培养基中进行产酶动态分析，通过实验得到如下结论：[1]、许多微生物都能产生植酸酶．[2]、在0.1％植酸钙为磷源的合成培养基中，白地霉、黑曲霉均在培养6天酶活最高；酿酒酵母、毕赤酵母培养3天酶活最高；黑曲霉产酶最高，可达9．6IU／ml；毕赤酵母7．21U／ml；酿酒酵母6．0IU／ml；白地霉最低，酶活仅5．0IU／ml．     

β3整合素酵母双杂交载体的构建及鉴定

根据Genebank，设计β3膜外区引物，通过RT—PCR方法扩增β3片段，然后克隆入RRS酵母双杂交载体——pYesM△playA中，构成猎物．限制性内切酶酶切鉴定表明载体构建正确，β3整合素测序正确．表明成功扩增出人β3整合素基因胞外区，构建获得郎β3-pYesM△playA酵母表达载体．用乙酸锂法，将重组子转染至酵母温度敏感株cdc25—2，检测其对RRS系统的激活作用．自激活试验为阴性表明郎整合素不能自激活cdc25—2在36℃生长，表明该载体可用于酵母双杂交检测β3整合素与汉坦病毒受体结合蛋白（VAP）间相互作用．为进一步研究β3整合素在病毒感染中的作用奠定了基础．     

营养保健型发酵饼干的研制

试验利用活性干酵母对硒的生物转化和富集能力,以亚硒酸钠为硒源,获得富含有机硒的酵母,然后以优质面粉为主要原料,利用富硒酵母的发酵作用,加工出一种营养保健型发酵饼干。     

用酵母α—因子系统表达外源基因

本文系统介绍了基因工程技术中目前使用较多的外源基因产物的表达系统——酵母α-因子。着重讨论了转化效率、质粒稳定性、产物分泌水平等方面,对如何进一步提高表达水平也提出一些建议。     

酵母双杂交系统在本科实验教学中的应用

酵母双杂交系统是目前鉴定体内蛋白相互作用最有效、应用最广泛的一项技术。为了将其运用于本科实验教学,设计了"利用酵母双杂交系统验证HIF-1α与Jab1相互作用"综合性实验。实验包括检测HIF-1α和Jab1在酵母细胞中的表达、毒性及自激活检测、HIF-1α与Jab1相互作用验证三部分。实验操作性强、结果直观,有利于学生深入、系统地理解并掌握酵母双杂交系统技术,有利于提高学生的科研思维及科研素养,有利于促进教学与科研的相互融合。     

果蝇GAL4/UAS系统在本科遗传学实验中的应用

GAL4蛋白是酵母中的一类转录因子,它能够与特定的上游激活序列结合,并驱动UAS下游基因的表达。将酵母中的GAL4和UAS元件分别引入到果蝇中,含有UAS-目的基因的转基因果蝇品系,无法在亲本中表达,只有与驱动者GAL4品系杂交后的子一代中,目的基因才会表达。在本科遗传学实验中,引入eyelessGAL4和UAS-Ras转基因果蝇品系杂交实验,通过观察F1代复眼中原癌基因ras表达后的表型,使学生了解如何通过GAL4-UAS系统在模式动物黑腹果蝇中实现靶基因的时空表达,认识GAL4-UAS系统在研究果蝇遗传发育中的重要性和优越性,理解分子调控、靶基因表达与个体的遗传和发育每个环节都是可以操作和控制的现代遗传学实验理念。     

解脂耶氏酵母杂合启动子的构建

目的：构建一系列新的用于解脂耶氏酵母的杂合启动子。方法：采用PCR技术将pXPR2的一段上游激活序列(UAS-1B)进行了离体串联重复，得到了一系列拷贝数不同的串联重复体，并将其克隆到了pTEF启动子的上游．结果：通过酶切鉴定，确证得到了含有UAS-1B重复单元数目不等的杂合启动子．结论：本方法实用可行，并构建了一系列杂合启动子，为进一步构建高表达水平的解脂耶氏酵母表达栽体奠定了良好的基础。     

固定化酵母菌发酵对酒精品质的影响

进行了固定化酵母与游离酵母产酒精发酵实验.通过测其酒精体积分数、酸度、糖度进行对照比较,分析固定化酵母与游离酵母在产酒精等方面的差异.结果表明,在酒精体积分数方面,固定化酵母发酵比游离酵母发酵酒精体积分数高40%左右;在酸度方面.固定化酵母发酵液比游离酵母发酵液酸度更稳定,变化更小;在糖度方面,固定化酵母发酵液比游离酵母发酵液糖度低15%左右.固定化酵母细胞在发酵产酒精方面与游离细胞相比,具有很大的优势.     

酵母产物对断奶仔猪肠道形态、屏障功能、细胞因子表达和抗氧化系统的影响（英文）

目的:验证添加酵母混合物(酵母培养物、酵母细胞壁水解物和酵母提取物)对断奶仔猪生长性能、腹泻发生率、肠道形态、屏障功能、免疫反应和抗氧化系统的影响。创新点:考察酵母培养物、酵母细胞壁水解物和酵母提取物混合物对断奶仔猪的协同作用。方法:90头21日龄断奶仔猪随机分为3组,分别饲喂基础日粮(对照组),含1.2 g/kg的酵母混合物(YP组)及含20 mg/kg硫酸粘杆菌素日粮(CSE组)14天,比较三组间各项指标差异。结论:结果表明,三组之间平均日采食量、平均日增重和料肉比无显著差异。YP组腹泻发生率显著高于其它两组。对照组十二指肠和空肠的绒毛高度以及十二指肠的隐窝深度显著高于YP组和CSE组。相对于对照组或CSE组,YP组十二指肠和空肠绒毛淋巴细胞数目显著增加,而回肠绒毛内淋巴细胞数目显著降低。相对于对照组,YP组空肠和回肠内白介素-10(IL-10)的分泌增加,YP和CSE也显著影响了仔猪肠道和血清中抗氧化因子;YP和CSE组血清D-乳酸浓度和二胺氧化酶活性都增强;YP组或CSE组肠道occludin和ZO-1 mR NA表达降低。综上所述,酵母混合物添加会增加断奶仔猪腹泻发生率,并对断奶仔猪肠道形态学和屏障功能具有副作用。