少棘蜈蚣候选杀虫肽κ-SLPTX-Ssm2b的原核表达与纯化

通过搜索NCBI数据库,获得了与具有昆虫毒性的少棘蜈蚣毒素κ-SLPTX-Ssm2a高度同源的毒素分子κ-SLPTX-Ssm2b.通过密码子优化并全基因合成获得了其DNA序列,利用RF-cloning技术将κ-SLPTXSsm2b插入到表达载体pet-HIS-SUMO,通过自动诱导表达技术在大肠杆菌BL21(DE3)诱导融合蛋白表达,通过镍柱纯化并用Ulp1激酶切割sumo标签并释放毒素分子,通过MALDI-TOF质谱鉴定其分子量为3 390.4658Da.研究结果表明获得了与理论分子量(3391.04Da)一致的κ-SLPTX-Ssm2b目的毒素分子,其表达产量为2.1mg/L,为进一步研究该候选杀虫肽分子的生理活性奠定了基础.     

少棘蜈蚣活性物质提取工艺研究

以预处理的少棘蜈蚣为原料,通过单因素试验考察了提取溶剂、提取时间、提取功率以及料液比等工艺参数对提取效果的影响,并通过正交试验设计优化了提取工艺。研究结果表明,少棘蜈蚣活性物质最佳提取方案为：提取溶剂为丙酮,提取时间为30 min,提取功率为600 W,料液比为1∶20,蜈蚣活性物质的提取得率最高,为13.87%。     

水生植物凤眼莲Ca2＋-ATPase的原核表达与蛋白纯化

从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白．     

昆虫神经毒素AaIT原核表达、纯化及抗体制备

人工合成Aa IT的成熟基因,连接到p ET32载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化重组Aa IT蛋白并免疫小鼠,经蛋白质-G柱对抗血清进行纯化.研究结果表明,纯化得到了Aa IT蛋白经免疫小鼠和纯化抗血清得到了特异性强的Aa IT抗体蛋白.     

人超氧化物歧化酶（SOD）基因的原核表达与蛋白纯化

从人直肠癌细胞株Colo320中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶（BamHI,Sinai）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约44kD相吻合的融合蛋白带,获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepha—rose4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白．     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

将人细胞周期蛋白D1基因克隆入原核表达载体pET-20b中获得重组质粒pET-20b-eyeD,经酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21PlaysS后获得表达菌株．该菌株经IPTG诱导后表达的目的蛋白有部分分泌到培养基上清中,将培养基上清中的蛋白沉淀后用Ni^2＋螯合柱进行纯化,最后可得到纯度达到95％以上的目的蛋白．蛋白电泳显示纯化蛋白的分子量约为33KD,Westemblot分析表明,在电泳胶的相应分子量处出现特异性条带,说明已经成功表达和纯化了重组人细胞周期蛋白D1．     

绿色荧光蛋白的原核表达和纯化及鉴定的实验设计与实践

该文以绿色荧光蛋白FRP为实验对象,通过设计原核蛋白表达、镍柱亲和纯化、荧光光谱分析、SDSPAGE电泳分离、Western blotting免疫印迹及蛋白质质谱鉴定等内容的生物化学综合实验,提高学生的生物化学实验技能。荧光光谱分析表明,纯化的GFP蛋白的最大激发波长为480nm,最大发射波长为500nm,与已知的GFP荧光光谱基本相同。SDS-PAGE电泳分离发现,GFP的亲和纯化效果好,且纯化得到的GFP分子量约为27kDa,与理论值相符。该实验适用于生物科学专业本科生系统完整地学习蛋白质表达、纯化和鉴定的实验方法,具有很好的综合性,取得非常好的教学效果。     

拟南芥热激因子HsfA1a部分氨基酸的表达与纯化

以构建的表达拟南芥热激因子HsfA1a C端氨基酸331到氨基酸486（简称△HsfA1a）的大肠杆菌Ecoli M15为材料,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IVFG）诱导表达△HsfA1a,再通过Ni—NTA—Agarose亲和层析纯化表达的△HsfA1a,通过SDS—PAGE电泳分析表达蛋白和纯化蛋白,获得了表达纯化的△HsfA1a．     

果蝇EF-1α蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为进一步研究延长因子-1（elongationfactor-1α,E-1α）在调控心脏发育和果蝇心脏功能中发挥的作用,制备延长因子-1的抗体．利用生物信息学选择果蝇EF-1α基因抗原亲水区,并设计出特异性引物,PCR扩增出的片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E．coli中后通过IPTG诱导融合蛋白表达,将His—EF-1α融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,再用WesternBlot检测抗体的效价和特异性．研究结果表明,获得了EF-1α原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗EF-1α多克隆抗体．EF-1α多克隆抗体的效价可以达到1比1500,并且有很强的特异性,为后续研究EF-1α基因在心脏发育和心脏功能中的作用奠定了基础．     

耐辐射异常球菌渗透诱导蛋白基因osmC的克隆表达纯化及生物信息学分析

耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)osmC基因(DR_1538)编码的渗透诱导胁迫蛋白是一种在氧化胁迫中起重要作用的过氧化物酶.用PCR方法从耐辐射异常球菌中扩增出osmC基因的全长序列(441bp),采用原核表达系统对其进行表达纯化,获得了分子量大小约为18.7 kDa的带有His标签的融合蛋白.利用在线网站对OsmC蛋白的生物信息学分析,结果表明:OsmC蛋白由146个氨基酸组成,理论等电点为5.81,为亲水性蛋白;二级结构主要是由α-螺旋及不规则卷曲组成.OsmC蛋白的纯化及生物信息学分析为后续深入研究其功能奠定了基础.     

亚洲玉米螟肽聚糖识别蛋白OfPGRP-SA的表达与功能分析

目的:明确肽聚糖识别蛋白PGRP在亚洲玉米螟先天免疫中的功能。方法:构建质粒表达载体,进行重组蛋白表达、纯化及Western blot鉴定,对获得的OfPGRP-SA重组蛋白进行抗菌活性、细菌凝集、酰胺酶活性、酚氧化酶反应和黑化反应等体外试验。结果:通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,OfPGRP-SA蛋白纯化后条带单一,与预期大小一致。对重组蛋白体外活性分析表明,OfPGRP-SA对革兰氏阳性菌有较强的诱导作用,说明OfPGRP-SA可能参与Toll途径的激活。结论:进一步明确OfPGRP-SA在亚洲玉米螟先天免疫应答中的作用,有助于更好地利用病原微生物对亚洲玉米螟进行生物防治。     

弓形虫主要表面抗原1截短型片段的克隆与表达

为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR) 从弓形虫RH 株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性.