重组链球菌溶血素(SLO)的原核表达、纯化

目的构建SLO原核表达质粒,重组蛋白的诱导表达并纯化。方法提取链霉菌溶血素O模板DNA,PCR法扩增slo基因。构建融合表达重组质粒p GEX-6p-1-slo和pet32a-tev-slo,将正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21-DE3,使用异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白。采用亲和层析纯化重组蛋白,切除标签后,再通过亲和层析纯化,获取SLO重组蛋白。结果 PCR扩增出slo基因,基因片段(1700 bp)与理论一致。经SDSPAGE,蛋白质印迹显示重组蛋白相对分子质量为55 k Da,与数据库中的相对分子质量结果相符。结论成功构建了slo原核表达质粒,表达并纯化了SLO重组蛋白。     

肺炎衣原体膜表面蛋白重组质粒的构建

目的 构建表达肺炎衣原体膜表面蛋白(OMP)的重组质粒，并在火肠杆菌中表达获得基因重组蛋白．方法用高保真PCR方法从肺炎衣原体扩增OMP片段．双酶切后插入原核表达质粒pQE-30，在大肠杆菌M15中表达，结果重组质粒经双酶切鉴定与目的基因长度相符；各表达蛋白经SDS-PAGE分析，相对分子量与文献相符．结论该重组质粒可用于核酸疫苗的备选质粒，基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于肺炎衣原体检测试剂盒的制备。     

人甲胎蛋白基因的克隆和表达

目的 构建表达人甲胎蛋白(AFP)的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法 用PCR方法从人胎肝组织中扩增AFP基因片断，将其转入原核载体质粒pCEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在BL21DE3中表达。结果 重组质粒pCEMEX-AFP的AFP基因序列经分析与GenRank公布序列相符，各表达的蛋白经Western Blot检测有抗原性。结论 基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效的肿瘤抗原。     

马传染性贫血病毒gp90蛋白的表达及其在诊断中的潜在应用

以质粒pVRCSV1.0-syn-gp90,利用PCR扩增马传染性贫血病毒外膜蛋白基因(gp90),构建了原核表达质粒pET-28a(+)-gp90,然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达并纯化该重组蛋白,ELISA和Westem blot证明马的阳性血清可以识别该重组蛋白.以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,测定的效价为1:13,000.     

中国小麦花叶病毒运动蛋白基因的克隆及其表达

应用RT-PCR技术从小麦病叶中扩增得到中国小麦花叶病毒(CWMV)的运动蛋白(MP)基因,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中得到大量表达,并以含表达产物的凝胶为抗原,免疫小鼠制备特异性抗血清,同时将MP基因重组到质粒pGBKT7中,电击转化酵母Y187菌株。Westernblot分析表明MP基因在酵母体内能以融合蛋白的形式正确表达,并具有免疫活性,可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。     

Asia Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因C末端在大肠杆菌中的表达与纯化

本试验用VP1基因C末端与表达载体连接,转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,收集不同时间段的菌液进行SDS-PAGE,结果表明重组的VP1基因C末端蛋白在大肠杆菌中能高效表达,表达的目的蛋白分子量约为16kd,而且重组菌诱导裂解物可在16kd处看到一条特异的蛋白条带,与预期大小一致,阴性对照未出现表达条带,而且重组菌在IPTG终浓度为1mmoL/L诱导6 h时表达量最大。表达产物主要以包涵体的形式存在,提取和裂解包涵体后,进一步纯化表达的目的蛋白,可获得纯度达70%以上的目的蛋白。     

人内脂素的原核表达和分离纯化

目的:构建Visfatin原核表达质粒,诱导表达并纯化重组人内脂素(Visfatin)。方法:从人LO2细胞中提取总RNA后,经RT-PCR法得到人Visfatin的c DNA序列,用以构建带HIS标签的Visfatin重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni柱亲和层析纯化融合蛋白。结果:PCR扩增出的目的基因片段为1600 bp左右,与理论大小一致。SDS-PAGE、Western blot、质谱分析数据证明了蛋白是Visfatin融合蛋白。结论:成功的表达并纯化得到带HIS标签的Visfatin融合蛋白。     

弓形虫SAG2表面抗原的克隆与原核表达

目的:扩增弓形虫SAG2基因,构建pGEX-4T-1-SAG2重组质粒,在大肠杆菌中表达。方法:设计并合成引物,经PCR法扩增SAG2基因序列,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-SAG2质粒,经酶切鉴定、测序,与pGEX-4T-1载体连接,构建pGEX-4T-1-SAG2质粒。将重组质粒转入大肠杆菌诱导表达,进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果:扩增出约561bp的SAG2基因序列,成功构建pGEX-4T-1-SAG2质粒,并在大肠杆菌中得到高效表达,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%。SDS-PAGE电泳显示pGEX-4T-1-SAG2的融合蛋白的分子量约为45kd。Western-blot显示融合蛋白有良好的抗原性。结论表达质粒在大肠杆菌中得到高效表达,为进一步研究弓形虫病的诊断做好准备。     

IL-18-GPI融合蛋白的表达及其免疫增强作用的研究

目的:构建真核表达IL-18-GPI融合基因的表达载体,观察融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达动力学及生物学活性,为进一步研究细胞因子作为免疫增强剂在临床肿瘤治疗中的应用奠定基础.方法:通过RT-PCR的方法从脂多糖刺激的外周血淋巴细胞中钓取IL-18基因,通过共用限制性酶切位点与GPI相连形成pcDNA-IL-18-GPI真核表达质粒.将质粒转染CHO细胞后建立稳定表达融合蛋白的细胞株用于融合蛋白的提取.对提取纯化的蛋白进行生物学特性、蛋白质转移分析和γ-IFN诱导实验.结果:获得714 bp的核酸序列并构建重组质粒pcDNA-IL-18-GPI.SDS-PAGE和West-blot显示在CHO细胞中表达的IL-18-GPI融合蛋白分子量约为27.5 kD,该蛋白具有明显的蛋白转移和诱生γ-IFN的作用.结论:IL-18-GPI融合蛋白是一种潜在的肿瘤疫苗增强剂,具有良好的应用前景.     

叶绿体中表达外源蛋白的研究进展

植物叶绿体可以作为生物反应器表达外源重组蛋白。在叶绿体中表达抗原、抗体、抗癌因子、蛋白类抗生素等药用蛋白,能够大大降低生产成本,同时更加安全,具有巨大的商业价值。经过近些年来的研究和改进,目的蛋白在叶绿体中的表达量有了很大的提高;在叶绿体中生产出来的一些药用蛋白质通过小鼠实验验证,具有高的免疫原性,为商业化生产医用蛋白奠定了基础。本文对在叶绿体中表达外源蛋白的最新研究进展进行了综述。     

五种重组人源IL-18突变子表达质粒的构建及其在BxPC-3细胞中的表达

目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础.方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平.结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达.     

厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因af1在大肠杆菌中的表达

厌氧真菌能够产生高比活力的纤维素酶,但由于对厌氧环境的生产条件要求严格,生长速度缓慢,并不适合规模生产。本研究将厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因af1与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接,得到重组质粒pET-28a(+)-af1。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,重组质粒转化后获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-af1。采用SDS-PAGE蛋白电泳对重组大肠杆菌的表达产物进行分析,在40 kDa附近得到与目的基因af1表达蛋白理论值相当的明显条带。AF1酶蛋白的最适pH为6.0,最适温度为45°C。重组大肠杆菌的摇瓶产酶试验结果显示:诱导培养18 h时,内切型-β-葡聚糖酶(CMC酶)活力可达410 U/mL。该项研究工作为进一步构建内切型-β-葡聚糖酶高产菌株奠定了良好的基础。     

重组肠激酶在大肠杆菌中的发酵与纯化

对重组肠激酶在大肠杆菌中的高密度发酵表达条件、纯化方法及其生物活性测定进行了研究。结果表明:在E.coli表达系统中,控制温度为37℃,培养基pH 7.4,当A600为8.0时,加入0.3mmol/LIPTG进行诱导,温度降低至30℃,连续诱导3 h,蛋白表达量达25%。经SDS-PAGE测定,纯化的重组肠激酶纯度达80%以上,并能高效切开融合蛋白。     

PHD类转录因子GmPHD2和Bar基因的植物表达载体的构建

利用高保真PCR酶从克隆载体pMD18T-GmPHD2中扩增出大豆PHD类转录因子GmPHD2,并于基因上下游分别引入XbaI和XhoI酶切位点;然后通过TA克隆、载体双酶切、连接、转化等技术手段,将其连入植物表达载体pBA002,构建了含GmPHD2和抗除草剂筛选标记Bar基因的植物表达载体pBA002-GmPHD2。重组质粒经PCR检测、双酶切及测序验证,表明GmPHD2基因已被完整、正确的插入到pBA002载体中,之后通过冻融法将重组质粒pBA002-GmPHD2成功导入农杆菌EHA105,利用此农杆菌不仅可以介导转化大豆,而且可以转化非同源的其他作物,为进一步开展植物抗逆性的基因工程研究提供了新基因资源。     

利用正向重复片段的GUS报告基因检测DNA双链断裂引起的基因重组研究

本研究建立了一种方便快捷地检测DNA双链断裂引起的基因重组的方法。传统的检测DNA双链断裂的方法较为复杂、繁琐。因此,构建简单、快速的此类检测技术是非常必要的。本研究构建了利用正向重复片段的GUS基因载体以及引导RNA和噬菌体MS2外壳蛋白偶联限制性核酸内切酶的基因组编辑系统,在GUS基因内部DNA重复区切割DNA,导致双链断裂(double-strand breaks,DSBs),DSB经同源序列引导修复(homology-directed repair,HDR)途径,引起GUS基因重组,恢复其功能。此方法可以经过GUS染色后快速、直观地检测位点特异的DSB。通过GUS与其底物的反应,以达到半定量、直观快速检测DSB的目的。     

保障同源重组的机制解析

中科院遗传与发育生物学研究所程祝宽研究组发现一个新的重组中间体蛋白MEICA1＋它是一个非常保守的真核生物蛋白．参与了同源重组保障机制,同时为育种过程中提高重组频率提供了基因资源．相关研究发表于《植物细胞》。     

保障同源重组的机制解析

中科院遗传与发育生物学研究所程祝宽研究组发现一个新的重组中间体蛋白MEICA1＋它是一个非常保守的真核生物蛋白．参与了同源重组保障机制,同时为育种过程中提高重组频率提供了基因资源．相关研究发表于《植物细胞》。     

Cre基因拼接及转基因细胞的构建

由于具有时间、组织和位点特异性,Cre重组酶介导的DNA重组己成为基因靶位操作的一个重要工具。本实验人工合成Cre基因片段,并将其准确拼接．然后在动物（猪）的成纤维细胞中表达,为接下来构建含Cre基因的转基因猪奠定基础。     

汉逊酵母(Hansenulapolymorph)表达系统通用技术平台

<正>i简介该项目经过多年的潜心研究,目前率先在国际上成功的开发了一整套能高效表达外源基因的汉逊酵母表达系统(17个表达载体)和汉逊酵母高表达基因的密码子用法。研究人员们成功的建立了一整套从表达载体构建到产业化发酵和蛋白纯化的通用技术平台。根据外源基因的种类不同,每升发酵液的表达量可达0.1-10克,非常适合大、中、小规模的企业     

医药卫生

细粒棘球蚴中国大陆株重组14-3-3蛋白基因的克隆和序列分析;中药哮喘康治疗支气管哮喘的临床研究;截短型A组轮状病毒VP6在E．coli中的高效表达;PDGF对人神经干细胞分化和甲状腺激素受体表达的影响;无血清悬浮培养昆虫细胞表达人纤溶酶原Kringle5的研究……