链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该1条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明：该基因为放线菌来源chs基因．分别在该基因5＇末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoRI酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple—T／chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点（PI）为5．41、分子量为3965道尔顿含有cHs保守功能区的酸性蛋白质．分析表明,该基因与Streptomyceslividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87．70％．测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中．     

牛ANGPTL1基因的电子克隆与序列分析

以牛的ANGPTL1基因为研究对象,利用生物信息学方法,对牛的ANGPTL1基因进行了电子克隆和序列分析,并对推导出的ANGPTL1蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛的ANGPTL1基因序列长为2576 bp,该基因的编码序列长为1 476 bp,编码492个氨基酸,编码序列的两翼有135 bp的5’非编码区和785 bp的3’非编码区。DNA序列的G+C百分含量为44.31%,A+T百分含量为55.69%。该基因的核苷酸序列与人、黑猩猩、鼠和狗ANGPTL1基因的cDNA序列的相似性分别为91%、90%、82%和93%。在氨基酸序列上与人、黑猩猩、鼠和狗的相似性分别为95%、95%、92%和95%。用氨基酸序列构建的进化树显示,在人、牛、黑猩猩、狗、褐鼠、原鸡几种动物中,牛与狗的亲缘关系最近。     

拟南芥Formin家族蛋白AFH14基因的克隆及功能结构域分析

应用RT-PCR的方法从拟南芥cDNA中克隆了AFH14的全序列,并对其功能结构域进行分析。发现所克隆的目的基因编码区全长3 102 bp,与基因组序列比对发现该基因包含18个内含子和18个外显子,编码1 033个氨基酸残基。通过与其它formin成员的序列比对分析,发现AFH14是一个典型的拟南芥II型formin,包括PTEN结构域。     

番茄（Lycopersicum esculentum）几丁质酶基因LeCHI的克隆与序列分析

根据GenBank发布的几丁质酶基因序列设计PCR引物,从叶片cDNA中克隆到了番茄几丁质酶基因,并命名为LeCHI,基因在NCBI中的登陆号为FJ849060。测序结果表明,LeCHI编码区全长为762 bp,编码253个氨基酸。RT-PCR检测表明,LeCHI基因在根、茎、叶和花蕾中均有表达。序列比对结果表明,LeCHI编码的氨基酸序列与同科的马铃薯、辣椒有较高的同源性。     

花生苹果酸脱氢酶基因的克隆及其蛋白序列分析

根据已知植物的苹果酸脱氢酶基因序列设计简并引物,采用RT-PCR技术从花生叶片中克隆得到苹果酸脱氢酶基因,命名为Ah MDH,Genbank登录号为KF499119,该基因编码区长度为1071bp,编码356个氨基酸。序列比对结果表明,Ah MDH编码蛋白与大豆、蒺藜苜蓿和豌豆等具有较高的相似性。     

八棱海棠类Caspase基因cDNA的克隆及序列分析

以八棱海棠cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE、5’RACE技术,获得了类天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)基因cDNA 1429bp的全长序列。序列分析表明,Caspase基因cDNA序列编码358个氨基酸,N端含有1个23个氨基酸的信号肽。进化树分析显示八棱海棠与山杏在该基因座位上亲缘关系最近,属于一个分支。     

小麦SOD基因的电子克隆及生物信息学分析

以NCBI中的EST数据库为主要数据来源,以一系列生物信息学软件为工具,进行了超氧化物歧化酶（SOD）基因的电子克隆及生物信息学分析。结果表明：通过电子克隆方法获得了SOD基因的编码区全长序列,该预测的SOD蛋白质氨基酸序列与数据库中同类基因的蛋白质氨基酸序列具有极高的相似性,并且含有完整的保守结构域;电子克隆到的SOD基因编码的不是分泌蛋白,也不是膜蛋白,而是胞质蛋白。通过某个基因的一个EST序列采用电子克隆的手段进行基因全长的电子拼接是可行的。     

七鳃鳗含硒谷胱甘肽过氧化物酶2的分子克隆、生物学特性及表达分析

谷胱甘肽过氧化酶2(GPx2),是生物体内重要的一类抗氧化酶,能够通过酶解过氧化氢阻断活性氧(ROS)的有害作用。本研究从七鳃鳗的血液c DNA文库中克隆了GPx2 c DNA全长和基因组DNA序列。序列分析表明,其c DNA全长为868 bp(Gen Bank序列号KM211710),包括53bp 5′非编码区、251bp 3′非编码区和564 bp开放阅读框,编码由187个氨基酸组成的多肽。基因组DNA序列(Gen Bank序列号KM211711)揭示了基因组特征含有2个外显子和1个内含子结构。系统发育分析表明,七鳃鳗GPx2(Lj GPx2)与其它的GPx2具有很高的同源性。利用实时荧光定量PCR检测到GPx2基因在七鳃鳗各组织中广泛表达,其中在口腔腺、心脏、卵、生殖腺中表达量较高。此外,用脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后发现,Lj GPx2 m RNA在生殖腺中表达量显著升高。本研究为探讨GPx2在七鳃鳗的免疫应答中的作用提供了理论依据。     

灰斑古毒蛾核型多角体病毒几丁质酶基因及其分子进化

通过对构建的灰斑古毒蛾Orgyia ericae单粒包埋型核型多角体病毒(OrerSNPV)基因组DNA的EcoRI酶切片段质粒文库的测序分析,在EcoRI—J片段(6．4kb)中鉴定出了编码几丁质酶(ChiA)基因开放阅读框(ORF),chiA基因编码区由1695bp组成,编码564个氨基酸,预计蛋白质分子量为62kD。这也是首次在基因序列水平上研究OrerSNPV。将OrerSNPV ChiA氨基酸序列与其它已知的18种杆状病毒ChiA氨基酸序列联配比较,结果表明OrerSNPV与其它杆状病毒ChiA氨基酸有60．3—69．5％同源性,其中与BmNPV、CfDEFNPV和LdMNPV的同源性最高。根据氨基酸序列绘制的分子进化树表明杆状病毒chiA基因至少可以分为SlMNPV、GV和其它NPV三个分支,OrerSNPV与LdMNPV在进化树上关系最为接近。     

马氏珠母贝核糖体蛋白S13基因的克隆和序列分析

构建马氏珠母贝腹足SMART cDNA质粒文库,测序和在GenBank中进行同源性查找,得到了核糖体40s亚基S13基因的全长cDNA序列。马氏珠母贝S13的cDNA全长554bp,推测的开放阅读框位于27-479,编码151个氨基酸,其中亮氨酸16个,所占比例为10.6%。马氏珠母贝S13同鲶鱼以及真菌纲的球毛壳的同源氨基酸序列相似性分别为90.05%和72.85%,很保守,可以用于种以上生物的进化关系研究。聚类分析显示,马氏珠母贝与脊椎动物和昆虫的亲缘关系较近,同线虫、水稻、啤酒酵母和球毛壳等动植物、真菌等相距较远。     

观音竹蛋白激酶基因BmPti1启动子的克隆与序列分析

以观音竹（Bambusamultiplexvar．riviereorum）基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得蛋白激酶基因BmPtil的启动子片段,长度为1466bp,通过HamCARE启动子预测工具分析表明：该序列中除含有TATA-box、CAAT-box等基本顺武作用元件外,还发现1个参与生理周期调控的元件、1个厌氧诱导的顺式元件,1个干旱诱导的MYB结合位点、1个光诱导MYB位点、1个水杨酸响应元件、1个赤霉素响应元件、1个低温响应元件、2个ABA与VPl响应元件和2个激素响应元件．表明BmPtil基因的表达可能受干旱、光照、氧气、低温等环境因子以及脱落酸、水杨酸、赤霉素等激素的调控．此外,推测BmPtil基因的表达可能与植株的生理周期相关．     

鸡γ-干扰素的克隆和序列分析

根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用primer 5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序,测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列比较,两序列间同源性为100%.计算机软件对鸡γ-干扰素编码的氨基酸序列进行了抗原性分析,结果表明鸡γ-干扰素具有良好的免疫原性.     

龙竹和麻竹FT同源序列的扩增与序列分析

根据拟南芥Flowering Locus T（FT）基因和水稻Heading date 3a（Hd3a）基因的序列设计引物,通过PCR扩增的方法分别从麻竹和龙竹基因组DNA中各得到长为334bp的DNA片段.经BLAST检索、基因结构分析和编码蛋白功能域预测等分析,初步确定所得DNA片段可能是麻竹和龙竹中的FT同源基因的部分序列.     

猪圆环病毒Ⅱ型河南地方株ORF4的克隆及原核表达

根据GenBank数据库中猪圆环病毒Ⅱ型的基因组序列设计引物,采用PCR技术从病料基因组DNA中扩增出PCVⅡ河南地方株ORF4基因,全长180 bp,编码59个氨基酸.将该基因克隆至载体pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-ORF4表达载体.经PCR、酶切和测序鉴定后,转化表达菌株BL21（DE3）诱导表达.SDS-PAGE结果显示：ORF4能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为32 kD,且以包涵体形式存在.Western Blot检测结果显示,纯化后的ORF4蛋白能够与鼠抗6＆#215;His标签单克隆抗体发生特异性反应,为进一步研究PCVⅡORF4蛋白的特性与功能奠定了基础.     

西方蜜蜂一个新表皮蛋白基因的克隆和结构分析

利用西方蜜蜂雄蜂头部5’LongSAGE文库中的一组标签序列,在蜜蜂基因组序列第9号连锁群上定位一个新的西方蜜蜂表皮蛋白基因转录起始位点,并克隆了该基因的eDNA序列,继而利用此cDNA序列分析了该基因的内含子和外显子结构．分析结果显示：该基因的DNA序列长1253bp,含有4个外显子和3个内含子,其cDNA长598bp,编码一个169AA的富含Val和Pro残基（23．67％,20．12％）多肽序列．BLAST分析发现,该蛋白与已知的4个昆虫表皮蛋白序列的相似性为47．54％,且其C末端有一个共有基序,说明这5个蛋白可能属于同一个表皮蛋白家族．该研究结果提供了一个新的蜜蜂表皮蛋白基因,且该基因在雄蜂头部表达水平较高．     

南阳牛血液基因组DNA提取与ANGPTL4基因的PCR扩增

采集20例南阳牛的血液,采用酚/氯仿法分离白细胞提取基因组DNA,并且对ANGPTL4基因部分序列(677～998 bp)PCR扩增条件进行了优化。结果表明,获得的牛基因组DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,主条带清晰,表明获得的南阳牛基因组DNA可以用于后续实验;以所提取的基因组DNA为模板,优化ANGPTL4基因片段扩增的条件,结果表明,最理想的PCR扩增条件是模板量为2μL(50 mg/L),Taq聚合酶(5 u/μL)的量为0.8μL,退火温度为56℃,循环次数为35次。