慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染,与慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)的发病密切相关,其发病机理涉及到很多基因的共同参与.病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响,也可能是病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌发病机制的重要机制.酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用,是促进慢性病毒性肝炎发病机理研究,探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径.     

关于病毒的两个问题

1病毒的蛋白质外壳是否都留在宿主细胞的外面？ 中学生物学教材中提到噬菌体侵染细菌时，DNA进入到细菌的细胞中，而蛋白质外壳仍留在外面。有些学生则认为所有病毒都是以这种方式侵染细胞的。实则不然，这只是噬菌体侵染细菌的方式。     

骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达与纯化

骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein,BMP-2）具有多种生物活性,有潜在的药用价值.为探索利用基因工程技术重组BMP-2并在大肠杆菌表达系统表达的可行性.在大肠杆菌中重组和筛选BMp-2基因,SDS-PAGE电泳分析,显示外源蛋白带在相对分子量约12kD处,以离子交换层析DEAE和分子筛纯化蛋白,缓慢复性并在C2C12细胞内检测到其蛋白活性.     

人纤溶酶原激活物抑制剂—2在昆虫杆状病毒体系中的表达及纯化研究

0 前言 人的PAI—2是一种通过抑制纤溶酶原激活物来调节纤溶酶原激活过程的特异抑制网子。生化性质研究和临床应用需要大量的PAI—2蛋白,但通过纯化大规模培养的细胞上清和胎盘抽提液而获取PAI—2是很困难的。在大肠杆菌和哺乳运动细胞中也尚未获得高效表达。我们考虑到用昆虫杆状病毒表达载体系统(Bacul—ovir us expression vector system:BEVS)进行表达。 BEVS是一种比较新的载体宿主表达系统,它与细菌、酵母及哺乳动物细胞表达系统相比具有以下几个方面的优点:1)允许插入的外源基因容量较大;2)能高效表达。重组蛋白达到1～500mg/L;3)应用范围广泛。可以表达各种胞内、分泌和膜蛋白。如用的是多角体蛋白启动于为晚期启动子,可表达一些具有细胞毒作用的蛋白;4)通过双启动于载体或两种不同重组病毒共同感染细胞,可获得多种蛋白的同时表达;5)重组病毒可通过穿刺感染或与野生病毒共包装,形成具有多角体外壳的重组病毒口服感染幼虫,从而在虫体中表达。表达量常比胞内高10～100倍;6)安全。杆状病毒具有严格的宿主专一性,不感染脊椎动物或植物;7)表达蛋白与天然蛋白相似。可以进行高等真核细胞内的蛋白修饰,剪接及运输。 BEVS中作为基因表达载体的病毒是苜蓿尺蠖核型多角体病毒(ACNPV)和家蚕核型多角     

应用人延伸因子1α亚基启动子和人工转录激活因子提高外源基因在CHO细胞中的表达

来大志、翁少洁、于长明、齐连权、付玲、于婷、陈薇在《生物化学与生物物理进展》2004年第2期撰文指出:表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要.而表达载体中最为重要的元件是启动子,一些常用病毒来源的启动子,如巨细胞病毒即早期启动子(PCMV-IE)仅在S期激活,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖,这对于连续持久大规模培养的宿主细胞不现实.而人延伸因子1α亚基启动子(PEF-1α)不受细胞周期限制,且启动子强度高于PCMV-IE,对于大规模外源蛋白的生产较为理想.首先构建了基于PEF-1α启动子的哺乳动物细胞表达载体pED5,在增     

转基因技术的应用与发展

转基因技术能使生物体接受人们导入的体外基因．造成生物体的性状发生有利于人类的变化。这些基因所决定的性状往往能够遗传,因而在工农业生产。生物育种,以及医疗保健等方面具有非常重要的意义。此项技术,目前不仅已从实验研究阶段进入生产应用阶段,而且正不断向深度和广度迅猛发展。1转基因植物转基因植物技术是随着DNA重组、基因的遗传转化、植物组织培养、目的基因的整合与表达,及其检测技术等手段的建立而发展起来的生物技术。植物的遗传转化,是指运用生物学、物理学、化学等方法,将外源基因导入植物细胞所获得的转基因植株。…     

国内外基因工程技术发展情况简介

近年来 ,生物技术的开发与应用迅猛发展 ,处于核心地位的基因工程技术在医疗、医药卫生、工农业生产及科研等方面都取得了很大的进展。下面就基因治疗、基因工程药物及转基因动植物三个方面作简单介绍 :1　基因治疗基因治疗是本世纪末 ,2 1世纪初被人们关注的热点问题之一。所谓的基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞 ,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病 ,达到治疗的目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人适当的受体细胞中 ,使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说 ,基因治疗还可包括从ＤＮＡ水平采取的治疗某…     

假单胞茵产弹性蛋白酶基因的克隆与表达

从假单胞菌（Pseudomonassp．）XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌（Escherichiacoli）中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框（0RF）克隆至融合表达载体pET30a（＋）进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E．coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20％;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性．     

昆虫杆状病毒在生物技术研究中的应用

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入，昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体，在昆虫细胞和虫体内表达外源基因，形成了昆虫杆状病毒载体表达系统，利用杆状病毒携带外源基因，通过同源重组将外源基因导入到家蚕的基因组构建了转基因家蚕；通过向杆状病毒基因组中插入毒素、激素、酶抑制剂等的基因或从杆状病毒基因组中删除某个基因，或通过不同杆状病毒间的杂交，使子代病毒的宿主域扩大，从而提高了杆状病毒作为生物杀虫剂的杀虫效果。本文对杆状病毒在上述几个方面的应用进行了简要综述。     

基因工程专题辅导提纲

基因工程是指将某特定的基因(DNA片段),通过载体或其他手段送入受体细胞,使它在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。采用基因工程的方法,能够将一种生物DNA片段(外源基因)导入另一种生物体内,使两者的遗传物质结合起来,以改变其遗传结构,从而创造出新物种或新品种。1 基因工程操作的主要步骤1.1 获取目的基因(外源基因) 利用基因“剪刀”——DNA限制性内切酶,将外源DNA切成许多片段,从中获取所需要的目的基因。1.2 目的基因和载体连接载体是基因的“运输工     

毕赤酵母直接基因敲除方法的研究

甲醇营养型巴斯德毕赤酵母已被广泛应用于外源蛋白的表达,但是作为一个外源蛋白表达系统,其还有待进一步完善。进一步提高外源蛋白的表达量以及形成折叠正确的目的蛋白,成为了改造毕赤酵母菌株的一个热点。基因缺失,是一个常用的改造和构建新的毕赤酵母重组菌株常用的方法。巴斯德毕赤酵母直接基因缺失方法主要分为两类:有标记的插入替换和无标记的Pop-In/Pop-Out。本文系统地介绍了这两种方法,分别比较了各自的优缺点,为它们在巴斯德毕赤酵母中进行基因敲除提供了一定参考意义。     

噬菌体侵染大肠杆菌的放射性分析和误差分析

<正>噬菌体侵染细菌的实验是"DNA是遗传物质"的主要证据,所以在高考题中经常出现,而对于噬菌体的同位素放射性示踪技术的结果分析是重难点,而且误差分析还是学生头疼的疑难点。本文以两个例题为载体,就此类问题解题注意点进行探讨。一、例题呈现例题1图1为用标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌(T_2噬菌体专性寄生在大肠杆菌细胞内)的实验,据图判断下列叙述正确的是     

棒状杆菌表达载体的构建

ｐＧＡ４６－４是一个带有谷氨酸棒杆菌妄动功能片断的质粒。用ＰＣＲ技术从ｐｇａ４６－４中扩增该启动子片断，将该启动子Ｔ４噬菌体Ｐ３２基因的终止子克隆到大肠杆菌质粒ｐＫ１８上，再接入棒状杆菌粒ｐＸＺ１０１４２构建一穿梭表达载体。     

“转化”的定义与“影印法”——对2016年高考全国理综乙卷第40题的探讨

<正>1试题某一质粒载体如图1所示,外源DNA插入到Amp~r或Tet~r中会导致相应的基因失活(Amp~r表示氨苄青霉素抗性基因,Tet~r表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有3种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下     

植物基因工程

植物基因工程是近20年随着DNA重组技术、基因遗传技术及植物组织培养技术的发展而兴起的生物技术。其目的是通过导入外源基因对植物基因遗传进行转化，使作物具有抗病、抗虫、抗逆环境、高产优质，以及生产药物和美化环境等方面的能力，从而使人类更大限度地利用植物资源。在植物基因工程中，最为关键的是植物基因转化技术。随着植物基因工程的不断发展，目前已形成了一整套较为成熟的植物基因转     

拟南芥PKS5蛋白激酶在大肠杆菌中的克隆及表达

介绍了以拟南芥PKS5蛋白激酶在大肠杆菌中的克隆及表达实验为蓝本,进行分子生物学实验教学模式改革。实验提取了拟南芥基因组DNA,并以此为模板用PCR法扩增出PKS5蛋白激酶基因,以pGEX-6P-1质粒为载体,构建pGEX重组质粒并将其转入大肠杆菌BL21中,筛选阳性重组子,用IPTG诱导pGEX重组子表达PKS5蛋白,最终通过SDS-PAGE检测得到约73 KDa的GST-PKS5融合蛋白。学生通过完成上述实验过程,有利于将其所学理论知识应用于实验,形成清晰完整的实验思路。     

水稻多顺反子质体表达载体的构建

根据发表的水稻叶绿体基因组序列，对比烟草高频同源重组目标区(NCBI编号：X15901)设计引物，用PCR的方法克隆到一段3．939kb叶绿体DNA片段，命名为crDNA．以其作为外源基因定点整合的同源重组片段，以来自烟草叶绿体的强启动子Prm、甘露聚糖酶man、绿荧光蛋白gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA和终止子psbA3’，构建水稻质体多顺反子表达载体pLM3(-psbCPrm—SD-man—SD-gfp-SD-aa-dA—psbA3’-tmm-)．并在大肠杆菌中通过平板定性对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定，结果表明：在大肠杆菌中，多顺反子盒式表达结构中的三个基因(man，gfp，aadA)均得到了表达．     

可治病的转基因食品——果蔬疫苗

早在现代医学产生之前，人们便自觉或不自觉地利用植物或植物中的某些天然成分来医治人类疾病。随着生物技术的发展，过去只能从稀有植物乃至其他生物体才能获得，或者收获量甚微的一些具有商业价值的物质，现在已有可能利用栽培作物来进行生产了。近10年来，将外源基因转移到植物细胞中，并由此产生一种经过基因改造的新植物的技术已经形成。科学家们正在将先进的植物生物学技术与现代医学研究的新进展结合起来，以开拓植物造福于人类的新局面。     

鲑鱼生长激素cDNA5'端和3'端的修饰与在原核细胞中表达的初步研究

为了研究鱼生长激素基因在大肠杆菌中的表达,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对鲑鱼生长激素ｃＤＮＡ的５端和３端进行定向修饰．将修饰后的三种基因分别克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＢＶ２２０,构建成重组鲑鱼生长激素表达质粒ｐＢＶＧＨ１１,ｐＢＶＧＨ１８和ｐＢＶＧＨ２４,转化大肠杆菌ＤＨ５α进行诱导表达．结果表明：核糖核蛋白体结合位点（ＳＤ）与起始密码子ＡＴＧ之间的距离对生长激素的表达水平影响极大．鲑鱼生长激素基因的终止密码子ＴＡＧ不能有效终止该基因在大肠杆菌中翻译的进行,造成部分通读．加入大肠杆菌强终止子ＴＡＡ可避免通读和产生超长蛋白,提高表达产量     

转基因动物乳腺生物反应器

自 1972年美国斯坦福大学的伯格教授 ,用病毒和噬菌体重组ＤＮＡ分子以来 ,基因工程技术不断完善和发展。以研究基因拼接与应用为主的基因工程 ,逐步演变为转基因、细胞融合、细胞克隆、细胞组织培养、微生物发酵、酶的研究与生产等综合在一起的生物工程技术。生物工程作为一项高新技术 ,首先在生产人类急需的生化药物上得到应用。例如 ,治疗糖尿病的胰岛素 ,用动物内脏提取 ,药源有限成本高 ,无法满足市场需求。将动物或人的胰岛素基因 ,转移到大肠杆菌的质粒上 ,组建成基因工程菌进行发酵生产 ,就可以取得大量的胰岛素。用基因工程菌生产…