辛基酚暴露对凡纳滨对虾NAGase的活力影响

以凡纳滨对虾为研究对象,让其暴露在含0,5,15,45,135μg/L辛基酚（OP）的养殖水体中,暴露24,48,72,96,120 h后取样,分析测定凡纳滨对虾壳膜与内脏 NAGase 比活力的变化．结果表明,水体 OP 对对虾壳膜 NAGase比活力基本起激活作用．暴露72 h内,壳膜 NAGase比活力无显著性变化;暴露96 h时,5,15,135μg/L OP均对虾壳膜 NAGase 比活力起极显著激活作用（P＜0．01）,45μg/L OP 对虾壳膜 NAGase比活力起显著激活（P＜0．05）;暴露120 h时,15,135μg/L OP 对虾壳膜 NAGase 比活力仍表现为显著性激活作用（P＜0．05）,但5,45μg/L OP 对壳膜 NAGase 的比活力影响无显著性．而水体 OP 对虾内脏 NAGase比活力基本起抑制作用．在15μg/L OP体系下暴露24 h,内脏NAGase极显著下降（P＜0．01）,其他 OP浓度下无显著性变化;不同浓度下暴露48 h,对虾内脏 NAGase比活力均出现极显著下降（P＜0．01）;5μg/L OP体系下暴露72 h,对虾内脏 NAGase比活力无显著性下降,其他 OP 浓度下的对虾内脏 NAGase 比活力均出现极显著下降（P＜0．01）;15,135μg/L OP 体系下暴露96 h,内脏 NAGase 比活力也分别出现极显著（P＜0．01）及显著性（P＜0．05）下降．可见,OP暴露对对虾生长发育会产生影响．     

凡纳滨对虾低盐度高产虾池理化因子研究

2002年9月至2003年9月,对珠海市凡纳滨对虾低盐度淡化高产养殖虾池环境理化因子及其变化进行调查研究,虾池水体盐度在1-6,平均水温28．2℃,透明度20 cm,溶解氧5．6 mg·L-1,pH值8．8,COD值23．38 mg·L-1;虾池无机氮含量相对低,氨氮平均含量为0．92 mg·L-1,亚硝基氮为0．11 mg·L-1,氨态氮为主要存在形式,无机磷含量较高,平均为7．7 mg·L-1．除水温外,虾池水体无机盐、溶解氧、pH的变化主要与人工调节有关．底质有淤泥的老化虾池水体pH、氨氮、COD值均比无淤泥虾池高,清淤可明显降低氨氮的含量．低盐度高产虾池环境理化因子的特点为高水温、高溶氧、高pH和高COD及低透明度,中后期养殖水体环境富营养化严重．     

凡纳滨对虾在不同实验条件下感染白斑综合症的研究

本研究目的是探讨在不同实验条件下的凡纳滨对虾人工感染白斑病毒(White Spot Syndrome Virus,WWSSV)的死亡率变化.研究结果如下,当凡纳滨对虾感染10-3、10-4、10-5WSSV(每尾注射剂量0.1mL),15天后的死亡率分别为(100±0)%,(78±2.3)%,(21±1.4)%.当养殖在高(100尾/m3)、中(50尾/m3)和低密度组(25尾/m3)的凡纳滨对虾感染10-4WSSV,15天后的死亡率分别为(91±2.7)%、(78±1.3)%、(63±1.9)%.在相同养殖密度下的凡纳滨对虾感染10-4WSSV,雌虾组和雄虾组15天后的死亡率分别为(67.3±1.83)%,(51±2.1)%(p＜0.05),白天的死亡率比晚上的低,差异显著(p＜0.05).另外,凡纳滨对虾注射感染的死亡率与投喂感染的死亡率比较,差异不显著(p＞0.05).     

不同组织来源的凡纳滨对虾NAGase的性质比较

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-D-glucosaminidase,简称NAGase,EC.3.2.1.52)与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的周期性蜕壳生长密切相关.以成虾外壳膜与肝胰腺为提酶材料,研究比较不同组织来源的NAGase活力与基本性质的异同.结果表明:不同组织来源的酶活力有差异,外壳膜NAGase活力为72 U/mg蛋白,肝胰腺的酶为60 U/mg蛋白;两种组织来源的NAGase酶促反应最适pH均为5.5,最适温度分别为30℃与37℃.并进一步比较不同部位来源酶的动力学参数(Km、Vm)、酶促反应活化能(Ea)及对Cu2 、Zn2 和Hg2 的敏感性等,阐明外壳膜与肝胰腺的NAGase酶学差异.     

人铁蛋白基因的克隆与原核表达

通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体．     

凡纳滨对虾良种选育关键技术及产业化应用

获奖单位中国科学院南海海洋研究所等完成人胡超群张吕平任春华等凡纳滨对虾(俗称南美白对虾)养殖是我国水产养殖的支柱性产业。由于凡纳滨对虾原产于南美洲,我国引进和培育的均是人工繁育养殖群体,易产生遗传衰退,现已出现生长速度减慢、淡化养殖成活率低、规格参差不齐等典型的种质衰退现象,导致我国优质亲虾每年都要依赖大量进口。因此,良种选育是关系到我国养殖成败和产业能否实现可持续发展的关键。项目研究取得成果如下:1.创立了家系配套杂交育种和制种核心技术,发现并利用了可遗传的淡水耐受性状,选育出"中科1号"新品种,获     

日本对虾Rab基因的克隆、结构分析与重组表达

通过3′RACE和5′RACE获得对虾Rab基因(命名为PjRab)的cDNA全长,其ORF为636bp,编码212个氨基酸.序列分析发现,PjRab具备Rab蛋白的基本特征,但在C-端与已知的Rab蛋白不同,可能是一种新的Rab蛋白,这是首次在海洋无脊椎动物体内克隆到该基因.对该基因进行了原核表达,并得到了有活性的表达产物.     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白Vp28基因的克隆、表达及蛋白纯化

以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶（SmaI,Not I）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白．     

对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化

采用PCR方法扩增对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因,插入到pGEX-4T-2表达载体上构建出带有目的基因的重组质粒pGEX-4T-2RR,然后将重组质粒转化大肠杆菌.转化菌经IPTG诱导后大量表达重组蛋白,通过降低诱导温度获得可溶性表达的重组蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白.     

玉带凤蝶铁蛋白亚基的鉴定及组织表达谱分析

生物体内的铁蛋白Ferritin在储存和释放铁离子、抗氧化胁迫和病菌侵染过程中发挥着重要作用.为探索玉带凤蝶(Papilio polytes)铁蛋白的功能,本研究开展了对玉带凤蝶铁蛋白亚基的鉴定,分析其组织表达谱和铁离子胁迫下的表达水平.基于玉带凤蝶基因组数据库,鉴定了铁蛋白轻链亚基(PpFerLCH)和重链亚基(PpFerHCH)基因并且克隆出2个基因的开放阅读框(ORF);利用生物信息学,对其结构域以及与其他物种的进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR技术分析两个亚基在不同组织以及铁离子胁迫下的表达水平.玉带凤蝶PpFerLCH基因cDNA全长为1207 bp,其开放阅读框为696 bp,编码231个氨基酸,预测其蛋白分子量为26.5 kDa,理论等电点为5.64;PpFerHCH基因cDNA全长为1 300 bp,ORF为636 bp,编码211个氨基酸,预测其蛋白分子量为23.7 kDa,理论等电点为6.53.结构域分析显示PpFerLCH和PpFerHCH都含有一个保守的铁蛋白结构域,而PpFerHCH具有Ferrihydrite nucleation center.系统发育树分析揭示PpFerLCH主要与烟草天蛾(Manduca sexta)以及大蜡螟(Galleria mellonella)铁蛋白重链亚基保持较高的同源性,而PpFerHCH与烟草天蛾具有较近的亲缘关系.实时荧光定量PCR分析表明PpFerLCH和PpFerHCH在玉带凤蝶的中肠和马氏管中表达量较高,而在其他组织表达量相对较低.此外,FeCl_3刺激24以后,PpFerLCH和PpFerHCH能够被显著诱导上调表达.本研究为进一步研究玉带凤蝶铁蛋白的功能奠定基础.     

南美白对虾TCTP基因表达分析

以β-actin为内参基因,通过荧光PCR方法,分析了翻译调控肿瘤蛋白（TCTP）基因在南美白对虾不同组织中的表达情况,结果表明,TCTP基因在对虾的各种组织中均有表达,但在肌肉中表达量最高,而心脏中的表达最低．     

肝素酶的原核表达与表达条件优化

利用PCR技术从肝素黄杆菌克隆到肝素酶HepI基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliBL21感受态细胞,获得基因工程重组菌．12℃下IPTG诱导表达12h,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得较高纯度的HepI酶蛋白．     

耐辐射异常球菌渗透诱导蛋白基因osmC的克隆表达纯化及生物信息学分析

耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)osmC基因(DR_1538)编码的渗透诱导胁迫蛋白是一种在氧化胁迫中起重要作用的过氧化物酶.用PCR方法从耐辐射异常球菌中扩增出osmC基因的全长序列(441bp),采用原核表达系统对其进行表达纯化,获得了分子量大小约为18.7 kDa的带有His标签的融合蛋白.利用在线网站对OsmC蛋白的生物信息学分析,结果表明:OsmC蛋白由146个氨基酸组成,理论等电点为5.81,为亲水性蛋白;二级结构主要是由α-螺旋及不规则卷曲组成.OsmC蛋白的纯化及生物信息学分析为后续深入研究其功能奠定了基础.     

日本七鳃鳗pcna基因克隆、生物信息学分析及真核表达

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),也称周期蛋白或DNA聚合酶的辅助蛋白,是真核细胞合成所必需的核蛋白,在DNA复制中起重要作用。前期实验发现日本七鳃鳗肝脏cDNA文库的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)中存在与高等脊椎动物pcna基因同源的序列。提取日本七鳃鳗(Lampetra japonica)肝脏组织RNA,通过RT-PCR方法扩增七鳃鳗pcna基因,对其进行生物信息学分析,并将Lj-pcna基因成功构建到pGFP-N2真核表达载体上,重组质粒PGFP-N2-Lj-pcna转染人Hela细胞,荧光显微镜下观察有荧光蛋白的表达。日本七鳃鳗pcna基因的真核表达载体成功构建和转染,为探讨七鳃鳗pcna基因功能研究及其它七鳃鳗相关研究提供条件。     

假单胞茵产弹性蛋白酶基因的克隆与表达

从假单胞菌（Pseudomonassp．）XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌（Escherichiacoli）中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框（0RF）克隆至融合表达载体pET30a（＋）进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E．coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20％;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性．     

海产和淡水养殖南美白对虾肌肉中无机元素的含量比较

应用石墨炉和火焰原子吸收光谱法,对海产和淡水养殖南美白对虾中的13种无机元素进行了比较分析;探讨了基体改进剂对实验效果的影响及仪器工作的最佳条件;实验结果表明,海产和淡水产虾体中均未测出Co;Pb、Cd含量均低于国家水产品卫生标准;除Na外,淡水养殖南美白对虾中K、Ca、Mg、Fe、Cu的含量均高于海产．两者虾体中Zn、Cr、Mn、Ni的含量相当,火焰法的回收率为90．67—109．00％,RSD≤2．21;石墨炉法回收率为90．50—107．45％,RSD≤3．67（n=3）．     

七鳃鳗含硒谷胱甘肽过氧化物酶2的分子克隆、生物学特性及表达分析

谷胱甘肽过氧化酶2(GPx2),是生物体内重要的一类抗氧化酶,能够通过酶解过氧化氢阻断活性氧(ROS)的有害作用。本研究从七鳃鳗的血液c DNA文库中克隆了GPx2 c DNA全长和基因组DNA序列。序列分析表明,其c DNA全长为868 bp(Gen Bank序列号KM211710),包括53bp 5′非编码区、251bp 3′非编码区和564 bp开放阅读框,编码由187个氨基酸组成的多肽。基因组DNA序列(Gen Bank序列号KM211711)揭示了基因组特征含有2个外显子和1个内含子结构。系统发育分析表明,七鳃鳗GPx2(Lj GPx2)与其它的GPx2具有很高的同源性。利用实时荧光定量PCR检测到GPx2基因在七鳃鳗各组织中广泛表达,其中在口腔腺、心脏、卵、生殖腺中表达量较高。此外,用脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后发现,Lj GPx2 m RNA在生殖腺中表达量显著升高。本研究为探讨GPx2在七鳃鳗的免疫应答中的作用提供了理论依据。