快速诊断小鹅瘟PCR方法的优化建立

为建立快速诊断小鹅瘟的PCR方法,根据已发表的GPV主要结构蛋白VP3基因序列,经多序列比对和Oligo6．0软件分析设计特异性PCR引物。以微量法提取病鹅肝组织DNA,优化PCR反应引物退火温度、循环次数和鉴定其特异性,并与酚氯仿法和煮沸法进行同步对比研究。结果显示,建立的PCR检测方法能够特异性检测病鹅肝组织中GPV的核酸,其扩增片段大小为343bp,最佳退火温度为58℃,最佳循环次数为35次。微量法提取的病毒核酸PCR检测灵敏度分别是酚氯仿法的50倍和煮沸法的2500倍。该PCR检测方法不与鹅副黏病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒以及健康鹅肝组织发生交叉反应。本研究建立的GPVPCR检测方法能够快速诊断小鹅瘟。     

实时荧光定量PCR技术的操作实践

采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBR(R) Green I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验.介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合熔解曲线、扩增曲线进行结果分析;强调了实验整体设计、引物设计与PCR反应体系的优化和内参的恰当选择在实时荧光定量PCR技术中的重要性.     

河北省圈养貉子隐孢子虫流行现状调查

目的:确定河北省圈养貉子隐孢子虫的流行和虫种/基因亚型分布情况。方法:从河北省多地共采集389份新鲜圈养貉子粪便样品,采用基于隐孢子虫核糖体小亚基rRNA(SSU rRNA)基因的巢式PCR方法进行检测,并对获得的隐孢子虫SSU rRNA基因阳性样本进行隐孢子虫60 kDa糖蛋白(gp60)基因的扩增,对获得的隐孢子虫SSU rRNA和gp60基因进行测序和分析,并分别在Mega中构建基于这2个基因的进化树(最大似然法),进一步分析所获隐孢子虫的分子特性。结果:基于隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR检测显示,河北省圈养貉子中共检测出6份隐孢子虫阳性样本,隐孢子虫感染率为1.5%(6/389)。其中,6月龄以上貉子的隐孢子虫感染率为1.2%(1/85),6月龄以下貉子的隐孢子虫感染率为1.6%(5/304),二者无显著差异(χ²=0.096,P=0.384)。粪便非正常的貉子隐孢子虫感染率(11.1%,4/36)显著高于粪便正常的貉子(0.6%,2/353)(χ²=23.18,P=0.001)。序列及进化树分析显示,本次从河北省貉子中分离...     

与PCR技术有关的常见问题答疑

PCR(polymerase chain reaction多聚酶链式反应)是一种在生物体外迅速扩增特定DNA片段的核酸合成技术,这项技术是由穆里斯(K.Mullis)等人于1988年发明的,为此,穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。本文针对一些学生有关PCR技术的常见问题予以解答。1PCR所需原料是普通的四种脱氧核苷酸吗?PCR反应体系为何不加ATP加入PCR反应体系的并非普通的四种脱氧核苷酸,而是四种脱氧核苷三磷酸(统称dNTP),即:dATP、     

简单快速的多糖植物双生病毒核酸提取方法

以朱槿曲叶病毒病株为材料,结合总DNA提取的CTAB法和质粒提取的离心柱方法,发展一种简单快速的多糖植物双生病毒基因组核酸的提取方法,用聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR予以验证。结果显示:与目前的2种常用方法相比,改进的方法在灵敏度、时间、价格和产率上都具有一定的优势,更适合于双生病毒基因组核酸的提取和检测应用。     

改良彗星实验和RAPD技术检测DNA损伤的实验研究

为了有效检测细胞DNA的断裂损伤效应和碱基突变,对彗星实验和RAPD技术进行改进和优化,建立了一套快速、稳定的实验流程。结果显示,改进后的彗星实验方法操作简便、耗时短、实验结果稳定,较好地解决了脱胶、细胞核分离操作繁琐、实验结果重复性低等问题;采用优化后的PCR反应体系和扩增条件,RAPD扩增条带清晰,分辨率高,实验结果稳定,重复性高。将改进和优化后的彗星实验与RAPD技术结合,可快速检测出细胞DNA断裂和碱基突变的损伤效应。     

平衡计分卡在中心药房绩效考核中的应用

目的:建立中心药房药师绩效考核方法,以改善中心药房的工作流程,调动药师积极性,提高服务能力。方法:应用平衡计分卡原理构建中心药房药师的量化考核体系,对2015~2016年的中心药房患者服务满意度、患者投诉和用药差错率等方面采用绩效考核Likert评分进行比较。结果:通过建立绩效考核制度,实施包括整理、整顿、清扫、清洁、素养和安全的6S管理,患者服务满意度从2015年12月的71.33%上升到2015年12月的92.83%(P0.001),2016年中心发药差错率为0.045‰,与2015年0.255‰比较有显著改善(P0.001),中心药房工作人员绩效考核Likert评分由2015年的64.4分上升至2016年的88.8分(P0.001)。结论 :平衡计分卡用于中心药房的绩效考核切实可行,可以提高药师工作的积极性、主动性和工作效率,是药学部实现科学管理的有效方法。     

基于排队论的全员核酸检测点优化设置

为解决居民参与全员核酸检测时因排队时间过长引发不满以及排队人数众多从而增加新冠病毒传染率等问题,根据对全员核酸检测过程中随机动态特征的研究,运用M/M/c排队模型,构建基于排队论的全员核酸检测点优化设置模型,以扬州主城区全员核酸检测为例,通过控制平均等待队长和平均等待时间,分别得到检测点窗口数为2和3时的最优服务强度及...     

南阳牛血液基因组DNA提取与ANGPTL4基因的PCR扩增

采集20例南阳牛的血液,采用酚/氯仿法分离白细胞提取基因组DNA,并且对ANGPTL4基因部分序列(677～998 bp)PCR扩增条件进行了优化。结果表明,获得的牛基因组DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,主条带清晰,表明获得的南阳牛基因组DNA可以用于后续实验;以所提取的基因组DNA为模板,优化ANGPTL4基因片段扩增的条件,结果表明,最理想的PCR扩增条件是模板量为2μL(50 mg/L),Taq聚合酶(5 u/μL)的量为0.8μL,退火温度为56℃,循环次数为35次。     

虎纹蛙微卫星位点的跨种引物筛选

利用近缘种中已发表的微卫星DNA标记引物,对虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus)进行跨种PCR扩增,但是获得了较低的跨种扩增成功率。研究结果显示仅有10个(约33.3%)位点在虎纹蛙能够获得成功扩增,而其中仅有2个(约6.7%)位点的扩增结果是没有拖带和非特异性的物种特异性扩增;46.7%的位点完全没有扩增产物,而20%的位点产物为该位点的非特异性扩增。本文认为影响两栖纲无尾目物种跨种扩增成功率的因素除了与该类群物种的基因组大小有关外,还与两栖类物种间的亲缘关系远近有关。     

家蚕微孢子DNA的PCR检测灵敏度研究

对纯化的家蚕微孢子的DNA抽提及PCR检测灵敏度进行了研究。结果显示:以0.1mol/L K2CO3 0.1mol/L KHCO3作为诱导剂诱导人工纯化的微孢子发芽是最佳选择,配合proteaseK法,能较好地抽提微孢子的DNA;PCR检测灵敏度研究发现,最低检测微孢子核酸浓度是3.25×10-2pg(25μl反应体系),溶液中只要有4粒微孢子即可检出。     

不同稀释液对标准品核酸定量结果的影响研究

对HBV 4th WHO IS 10/266(NIBSC)国际标准品稀释液进行选择和评估,筛选出稳定的对定值结果影响最小的稀释液,为PCR实验室标准品常规稀释提供理论基础和实验依据。通过选用不同浓度的稀释液,将国际标准品稀释成梯度,应用乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒进行准确度和最低检测限验证。准确度验证每个稀释度重复检测6次;最低检测限验证每个稀释度重复检测20次;根据准确度和最低检测限的对比测试结果筛选出最优的稀释液,同时用筛选出的稀释液分别将企业参考品Q2稀释至线性范围内各浓度,每个浓度重复检测2次,以理论值为Y值检测值为X分别进行线性拟合(Y=a X+b)。结果:第一,10%小牛血清①和小牛血清②以及50%阴性血浆②和100%阴性血浆①稀释后检测结果与理论值最接近,△Log均小于0.1;第二,10%稀释度的小牛血清和阴性血浆稀释后的检测下限全部检出,50%稀释度的阴性血浆①和阴性血浆②符合95%的检出限,而原倍的只有阴性血浆①和1x TE全部检出。第三,对筛选后的稀释液稀释的企业参考品各浓度样本进行核酸定量检测,以理论值为Y值检测值为X分别进行线性拟合(Y=a X+b),结果显示a值均介于1.00±0.05之间,R2都大于0.98,线性关系良好,没有显著差异。通过实验数据的对比分析,10%小牛血清作为稀释液,对国际标准品定值影响最小稳定性最好,可作为实验室WHO标准品稀释液。     

一株新的大口黑鲈弹状病毒(YH01)的分离、鉴定及其糖蛋白的杆状病毒表达系统的构建（英文）

目的:探究大口黑鲈弹状病毒株与其他已知弹状病毒的差异,构建该病毒糖蛋白的杆状病毒表达系统,用于后续口服疫苗的研发。创新点:基于获得的大口黑鲈弹状病毒的全基因组序列,并利用杆状病毒表达系统获得了高丰度的病毒糖蛋白,可结合家蚕用于后续口服疫苗的研发。方法:利用c DNA末端快速扩增法(RACE)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等技术获得了病毒的部分序列,拼接获得了病毒的全基因组序列。通过ClustalW比较该病毒与已知弹状病毒的3'leader及5'trailer序列差异,进一步利用MEGA软件比较该病毒全基因组序列与其他鱼类弹状病毒的差异,确定其系统进化树中的分支及地位。基于糖蛋白序列分析结果,利用杆状病毒表达载体构建该病毒的糖蛋白表达系统,感染昆虫卵巢细胞(SF9)后,借助荧光定量PCR(q RT-PCR)、免疫荧光及蛋白质印迹法(western blot)等技术确定病毒增殖及糖蛋白的表达情况。结论:该大口黑鲈弹状病毒株全长11 526 bp,且与鳜鱼弹状病毒为同一分支,属于水泡病毒属。构建的病毒糖蛋白杆状病毒表达系统成功在SF9细胞中表达了高丰度的糖蛋白。     

机械设计制造及其自动化专业实践教学体系建设研究

机械设计制造及自动化专业教学体系中,实践教学应当率先进行创新与优化,通过资源整合以及教学流程变革,努力造就综合素质高的实用型人才。广大教师要在思想认识上再提高,对现行实践教学体系进行充分优化,使其与行业发展、经济发展吻合,不断提高机械设计制造及其自动化专业的毕业生的综合就业竞争力。     

都支杜鹃ISSR扩增条件的优化

对珍稀濒危物种都支杜鹃的ISSR扩增体系中的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量和底物含量进行优化,并在优化后的基础上筛选出8条效果较好的引物,在梯度PCR仪中设置温度梯度,找到这些引物的最佳退火温度。优化结果表明,至少在一定的范围内底物浓度和Taq酶含量对PCR反应结果影响不大,相对而言,dNTP浓度和Mg2+浓度对反应结果的影响更加显著。优化后的15 ul PCR反应体系中包括20 ng模板DNA、0.3μM引物、1.5 ul Buffer(Mg2+free),0.5 U Taq酶、1.5 mM MgCl2和0.1 mM dNTP。     

银纳米基比色传感法测定水样中汞离子的方法

基于银纳米粒子在盐诱导下聚集使体系颜色发生改变这一原理,建立一种生物传感方法检测水样中的汞离子.采用柠檬酸还原法合成银纳米粒子并修饰以核酸适配体,汞离子与核酸适配体结合发生变构效应导致银纳米粒子暴露在盐环境中发生聚集,使体系光谱特征峰和颜色发生明显变化.研究体系特定波长吸光度比值与汞离子浓度的变化关系.在最佳优化条件下,该比色法在质量浓度区间为0.2~50 ng/mL呈现良好线性关系,检出限为0.11 ng/mL.将该检测体系应用于汞离子类似物的检测,特异性较好.该方法对水样中汞离子的检测有一定的应用前景.     

实时荧光定量PCR应用技术

实时荧光定量PCR(real- time quantitative PCR)由Higuchi等人在1992年第一次报告,是一种新兴的分子生物学技术,这项技术灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素.它将EB加入PCR反应体系,再通过改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度,这不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,同时也可以对核酸分子进行精确定量.而且随着PCR技术的不断发展,使得实时荧光定量PCR日益成熟,极大的推动了分子生物学的发展,更是在疾病诊断中发挥了很重要的作用.     

梅菜ISSR分子标记技术初步研究

以梅菜为研究对象,初步建立起梅菜的ISSR分子标记技术体系,包括DNA提取、退火温度、循环次数和引物筛选等。利用CTAB法提取梅菜的DNA,经电泳检测和紫外检测,质量较好,适合PCR扩增。对PCR反应体系和条件进行优化,多态性引物分别为809,841,842,845,退火温度为58℃,次数为40次,Tag酶用量为0．8U。本试验为梅菜的种子纯度鉴定和新品种选育提供技术依据。     

高等职业院校教学管理流程再造研究

当前高等职业院校教学管理存在管理理念滞后、运行机制不畅、信息水平低下、评价体系不全、队伍素质不高等问题。因此,要想有效解决当前高等职业院校教学管理存在的问题,必须借鉴企业业务流程再造理论,对高等职业院校管理运行机制、学生管理流程、教师管理流程和教学资源管理流程进行再造。通过对这些流程的再造,更新管理理念、提高信息水平、构建管理平台、建立管理制度、优化管理队伍,进而保障高职教学管理流程的顺利进行。     

哈密瓜SSR体系的建立及反应条件的优化

以新疆哈密瓜为试验材料,利用正交试验设计研究了4个主要因子(Mg2+、DNA聚合酶、SSR引物和dNTP)对SSR扩增结果的影响,并对该哈密瓜SSR反应体系进行了优化,同时尝试用降落(Touchdown,TD)PCR方法扩增目的片段.最终筛选出如下最佳反应体系:总反应体积为25 μL,其中dNTP 200 μmol/L,SSR引物0.75μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,Mg2+ 1.5 mmol/L;降落PCR省却了常规PCR中摸索最适退火温度的过程,对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增,是一种行之有效的方法.