以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体的构建及鉴定

饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功.     

血管内皮生长因子逆转录病毒表达载体的构建

将质粒pcDNA3．1-VEGF双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,并用酶切及测序等手段进行鉴定．而后利用脂质体转染包装细胞pA317,并检测病毒滴度．结果表明：成功构建了VEGF基因的重组逆转录病毒表达载体．     

人铁蛋白基因的克隆与原核表达

通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体．     

基因表达载体构建实验的拓展

在传统的双酶切方法基础上,利用同源重组原理同样可以将目的 基因连接在载体上,并且该方法可将目的 基因插入到载体上的任一位点,这极大地提高了载体的构建效率,也有利于学生对基因工程的进一步理解.     

从单酶切到双酶切看目的基因与运载体结合的准确率

2008年江苏省和海南省高考、2009年江苏省高考生物学试卷都考查了基因工程的酶切过程。题目新颖,体现了生物科学的时代特征。学生普遍反映难。究其原因,人教版教材（选修3）叙述的是早期基因工程的“单酶切”,而高考试卷讨论是现代基因工程的“双酶切”以及“双酶切”的优势,两者落差较大。     

“转化”的定义与“影印法”——对2016年高考全国理综乙卷第40题的探讨

<正>1试题某一质粒载体如图1所示,外源DNA插入到Amp~r或Tet~r中会导致相应的基因失活(Amp~r表示氨苄青霉素抗性基因,Tet~r表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有3种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下     

人超氧化物歧化酶（SOD）基因的原核表达与蛋白纯化

从人直肠癌细胞株Colo320中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶（BamHI,Sinai）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约44kD相吻合的融合蛋白带,获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepha—rose4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白．     

基因工程专题辅导提纲

基因工程是指将某特定的基因(DNA片段),通过载体或其他手段送入受体细胞,使它在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。采用基因工程的方法,能够将一种生物DNA片段(外源基因)导入另一种生物体内,使两者的遗传物质结合起来,以改变其遗传结构,从而创造出新物种或新品种。1 基因工程操作的主要步骤1.1 获取目的基因(外源基因) 利用基因“剪刀”——DNA限制性内切酶,将外源DNA切成许多片段,从中获取所需要的目的基因。1.2 目的基因和载体连接载体是基因的“运输工     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白Vp28基因的克隆、表达及蛋白纯化

以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶（SmaI,Not I）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白．     

水生植物凤眼莲Ca2＋-ATPase的原核表达与蛋白纯化

从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白．     

人鼻咽鳞癌细胞CNE1/R PECAM-1真核表达载体的构建

通过TA克隆技术及二步克隆的方法构建人鼻咽鳞癌细胞CNE1/R PECAM-1的真核表达载体。将已克隆至Pmd19-T Simple载体的PECAM-1基因片段使用Not/HindⅢ酶切,亚克隆至pcDNA3.1/myc-His(-)A载体并双酶切及测序鉴定。成功构建了人鼻咽鳞癌细胞CNE1/R PECAM-1的真核表达载体,为下一步建立人鼻咽鳞癌PECAM1基因过表达细胞系奠定了基础。     

重组大肠杆菌高效分泌表达α-1-6-葡聚糖酶

以pLF3为模板,PCR扩增得到葡聚糖酶的启动子,并将启动子基因重新连接到切除启动子基因及葡聚糖酶基因的pLF3载体上,构建pLF3-pro载体.采用PCR的方法扩增朱黄青霉总DNA中的α-1-6-葡聚糖酶基因,并插入到pLF3-pro载体上,构建pLF3-Pro-Dex质粒,以大肠杆菌DH5α为宿主菌,酶切验证及PCR验证均表明成功构建了pLF3-Pro-Dex质粒,且重组质粒中的α-1-6-葡聚糖酶基因与朱黄青霉中的α-1-6-葡聚糖酶基因有93%的同源性.     

浅谈运载体和限制酶在基因工程中搭配应用

人教版高中生物学全一册教材基因工程一节,介绍了限制性内切核酸酶和运载体,阐明了重组DNA的构建过程：先用限制酶切割运载体（质粒）,产生黏性末端,再用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同黏性末端,加入DNA连接酶,即可形成重组DNA分子（也叫重组质粒）。学生学习完这部分内容之后,由于对限制酶和运载体搭配使用及基因检测知识认识不够深入,易产生错误。     

植物表达双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta的构建

本研究将苏云金芽孢杆菌（bt）与半夏凝集素抗虫基因（pta）两类抗虫基因连接到具有高效性的植物表达载体pCAMBIA3300中,重组表达质粒分别经过ApaⅡ单酶切及xhoⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定、分析后,实验结果表明含有双价抗虫基因pCAMBIA3300-bt-pta的植物重组表达质粒已构建成功。     

对基因工程相关知识点的一些拓展和延伸

<正>高中《生物·选修3·现代生物科技专题》(浙教版)比较系统地介绍了基因工程的基本工具、操作步骤和应用,但是对有些内容只是一笔带过,在一定程度上给学生的自学和应试带来困惑。本文就基因工程中的一些相关知识点进行扩展,帮助学生更全面地了解基因工程。1是用单酶切还是双酶切?根据浙教版教材的介绍,基因工程处理目的基因和质粒载体的时候应使用同一种限制酶(单酶切)得到相同的黏性末端,再用DNA连接酶就可以得到重     

抗菌肽P113多拷贝表达载体的构建

目的:构建唾液抗菌肽P113基因多拷贝串联重组体,并将其克隆到表达载体pET-28a.方法:根据大肠杆菌偏爱的密码子设计并合成人唾液抗菌肽P113基因,采用PCR技术构建P113基因的自融合多拷贝串联重组体polyP113,BAMH I和HindⅢ双酶切表达载体pET-28a和polyP113基因,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性菌落,PCR、酶切、测序鉴定重组质粒.结果:所构建的含有十拷贝P113基因的重组体正确克隆到表达载体pET-28a上,无突变.结论:成功构建含十拷贝唾液抗菌肽P113基因表达框的大肠杆菌表达载体.     

凡纳滨对虾铁蛋白基因的克隆与表达

以凡纳滨对虾为研究对象,通过RT-PCR技术扩增出铁蛋白（Ferritin）基因,经特定的酶切（Notl,Smal）后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌．经菌落PCR和质粒双酶切鉴定确认,证实成功地构建了对虾铁蛋白基因的原核表达载体．再对重组菌用IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose4B亲和层析得到目的蛋白用于制备抗体,为研究铁蛋白在对虾抗病毒免疫中的作用奠定基础．     

拟南芥总RNA的提取及RT-PCR扩增CBF1基因

CBF1基因的扩增是研究植物抗旱基因的前期工作。本研究用Trizol试剂法提取模式植物拟南芥叶片的总RNA,经过反转录进行PCR扩增,将产物DNA回收后,连接PCR片段与T载体,电击转化入E.coli大肠杆菌感受态细胞;涂平板长出菌落,挑取半个白斑菌落电泳鉴定转化子;鉴定完成后提取质粒,用双酶切法进行鉴定,结果表明获得CBF1基因。     

mCherry标签融合SATB1真核表达质粒的构建

核基质结合蛋白SATB1调控染色质的空间结构,参与真核生物基因表达。本论文通过PCR获得SATB1目的基因,然后与载体mCherry-C1同时用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后,用T4连接酶进行连接。连接质粒转入感受态宿主细胞并在Kana抗性的LB培养基中培养。分离获得Kana抗性单克隆菌株并进行扩大培养后提取重组质粒。对重组质粒进行双酶切验证和DNA测序检测。本论文成功构建mCherry-SATB1真核表达质粒,为后续研究SATB1的功能机制奠定基础。     

一种地衣芽孢杆菌表达载体的构建

用PCR方法从地衣芽孢杆菌WH-08基因组DNA中分别扩增α-淀粉酶基因amyL启动子PamyL和终止子TT,用重叠PCR技术将两者连接,重叠PCR产物用Hind III和EcoR I双酶切后,与经相同酶切的载体PHY300 PLK连接,构建重组质粒PHY-PamyL-TT。该重组载体的构建为外源蛋白在地衣芽孢杆菌中的高效表达奠定了基础。