抑制转录后基因沉默的病毒蛋白及其抑制机制

植物中存在天然的转录后基因沉默机制来消除病毒对其的危害,而病毒也进化出不同的对策来逃避甚至消除这种抑制机制;目前研究发现黄瓜花叶病毒(CMV)的2b蛋白及马铃薯丫病毒(PVY)的HC蛋白等植物病毒蛋白能抑制植物转录后基因沉默,对它们相应的抑制机理已了解。研究转录后基因沉默抑制蛋白不仅有助于阐明RNA沉默的具体过程,也为未来的转录后基因沉默甚至RNAi的调控提供研究工具和思路。     

慢病毒载体介导的RNA干扰抑制TLR基因的表达

目的:研究慢病毒载体介导的RNA干扰对有TLR2 或者TLR4表达的小鼠来源的细胞株抑制干扰效率.方法:根据GeneBank小鼠的TLR2 或者TLR4基因mRNA的已知序列,在http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmL,寻找符合特征的靶序列.编码GeneBank模板的体外合成,收获病毒,侵染靶细胞,检测干扰效率.结果:检测表明干扰效果明显,达到80%以上.结论:慢病毒载体介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段,可以对小鼠TLR基因功能进行长期的研究,检测有关蛋白基因的表达,揭示TLR在当中的作用.     

水稻多顺反子质体表达载体的构建

根据发表的水稻叶绿体基因组序列，对比烟草高频同源重组目标区(NCBI编号：X15901)设计引物，用PCR的方法克隆到一段3．939kb叶绿体DNA片段，命名为crDNA．以其作为外源基因定点整合的同源重组片段，以来自烟草叶绿体的强启动子Prm、甘露聚糖酶man、绿荧光蛋白gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA和终止子psbA3’，构建水稻质体多顺反子表达载体pLM3(-psbCPrm—SD-man—SD-gfp-SD-aa-dA—psbA3’-tmm-)．并在大肠杆菌中通过平板定性对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定，结果表明：在大肠杆菌中，多顺反子盒式表达结构中的三个基因(man，gfp，aadA)均得到了表达．     

RNAi的研究进展

RNAi是通过双链RNA的介导特异性降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默．广泛存在于真菌、植物和动物等真核生物中．RNAi是自然界存在的生物抵抗病毒入侵、抑制转座子活动的一种防御机制,现已发展成为功能基因组学研究的重要手段之一．     

RNAi的研究进展

RNAi是通过双链RNA的介导特异性降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默．广泛存在于真菌、植物和动物等真核生物中．RNAi是自然界存在的生物抵抗病毒入侵、抑制转座子活动的一种防御机制,现已发展成为功能基因组学研究的重要手段之一．     

核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及hpRNAi载体的构建

多聚半乳糖醛酸酶是核盘菌致病力发挥作用的关键酶。本研究用PCR的方法从核盘菌基因组DNA中扩增出多聚半乳糖醛酸酶（PG5）基因片段,再以扩增出的PG5基因片段作为模板设计引物扩增出一个相应较小的片段。将两个PG5基因片段反向插入到植物表达载体2300 sn的35S启动子和nos终止子之间,构建出可转录表达出发夹RNA结构的组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰抗菌核病的基因工程研究奠定了基础。     

安全环保的烟草质体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据已发表的序列，通过PCR技术克隆了一系列构建烟草叶绿体多顺反子表达载体所需的元件：质体核搪体（16S）RNA操纵元启动子（Prrn）、质体面A基因3’端（psbA3’）、山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）、烟草叶绿体高频同源重组片段（psaA／psbC，大小3463bp）、甘露聚糖酶基因（man）、绿荧光蛋白基因（gfp）。构建了烟草质体多顺反子定点整合表达载体pLM7（-psaA-Prrn-SD-man-SD-gfp-SD-BADH-PSBA3’-PSBC-）。并在大肠杆菌中通过平板定性分析等方法对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定。     

苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)在烟草中的表达研究

近年来在拟南芥、水稻等物种中对赤霉素生物合成途径的研究日益完善,但苹果中的赤霉素生物合成途径尚未明确.文章通过构建苹果GA-3氧化酶基因MdGA3ox1的植物表达载体,并将该基因通过农杆菌介导法转化到烟草中来快速验证其在植物中的功能.结果发现:MdGA3ox1对烟草的表型产生了很大的影响,既有赤霉素过量的典型表型,也有非典型的表型.造成这种表型的原因可能有两个:一是在烟草赤霉素生物合成途径中,GA3ox不是最关键的基因;二是基因的表达需要特定的的转录因子,在烟草中的启动子和苹果中不同,结合的转录因子也不同,从而造成了表型的多样化.     

以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体的构建及鉴定

饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功.