幽门螺杆菌CagA蛋白与CTB融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的　构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法　采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和cagA基因.又用PCR法改造了水稻Wx启动子,在其3′端融合加入Ω序列和Kozak序列.通过一系列亚克隆最终将两个融合基因和NOS终止子插入根癌农杆菌双元载体pCAMBI A1300的表达框架内.结果　PCR验证和测序分析证明,CTB和cagA融合基因以正确的方向插入到载体pCAMBI A1300中,并位于水稻Wx启动子后.结论　成功构建CTB和cagA融合基因的植物表达载体,为幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础.     

金黄色葡萄球菌的引起的中毒分析

金黄色葡萄球菌(金葡菌)是葡萄球菌力最强的.广泛分布于空气、土壤、水及食具.人和动物具有较高的带菌率.由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒越来越多,据美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌.在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占45%,我国每年发生的此类中毒事件也非常多.     

FTA滤膜用于多重PCR检测蜜饯中三种食源性致病菌的研究

采用FTA滤膜从蜜饯中直接提取模板DNA,根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的phoP基因、福氏志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR,并对反应条件进行优化。建立的三重PCR具有准确、快速、高效的特点,为同时检测蜜饯中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌提供了新的方法。     

噬菌体抗体库技术在抗体研发中的运用

噬菌体抗体库技术是一种以噬菌体为载体,将外源抗体库基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中,并组装出具有扩增能力且在噬菌体表面无缺损表达抗体的融合噬菌体的技术。噬菌体抗体库技术已广泛运用于单克隆抗体的研发,它相对于传统的筛选技术,在时间周期,抗体类型,筛选范围,经济成本等有较为突出的优势。本文主要介绍噬菌体抗体库技术的原理、类型、运用以及最新研究进展。     

中国小麦花叶病毒运动蛋白基因的克隆及其表达

应用RT-PCR技术从小麦病叶中扩增得到中国小麦花叶病毒(CWMV)的运动蛋白(MP)基因,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中得到大量表达,并以含表达产物的凝胶为抗原,免疫小鼠制备特异性抗血清,同时将MP基因重组到质粒pGBKT7中,电击转化酵母Y187菌株。Westernblot分析表明MP基因在酵母体内能以融合蛋白的形式正确表达,并具有免疫活性,可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。     

弓形虫SAG2表面抗原的克隆与原核表达

目的:扩增弓形虫SAG2基因,构建pGEX-4T-1-SAG2重组质粒,在大肠杆菌中表达。方法:设计并合成引物,经PCR法扩增SAG2基因序列,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-SAG2质粒,经酶切鉴定、测序,与pGEX-4T-1载体连接,构建pGEX-4T-1-SAG2质粒。将重组质粒转入大肠杆菌诱导表达,进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果:扩增出约561bp的SAG2基因序列,成功构建pGEX-4T-1-SAG2质粒,并在大肠杆菌中得到高效表达,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%。SDS-PAGE电泳显示pGEX-4T-1-SAG2的融合蛋白的分子量约为45kd。Western-blot显示融合蛋白有良好的抗原性。结论表达质粒在大肠杆菌中得到高效表达,为进一步研究弓形虫病的诊断做好准备。     

鸡白细胞介素18全长基因的克隆、表达及分子进化分析

根据鸡白细胞介素18（IL-18）cDNA基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术,从脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激的我国地方品种萧山鸡原代鸡脾细胞中扩增并克隆鸡IL-18全长基因（Genbank accession,AY628648）。扩增片段全长591bp,共编码197个氨基酸的前体蛋白,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡IL-18全长基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性为98．99％。只在引导序列中出现两个氨基酸残基的缺失,分子进化分析表明萧山鸡IL-18基因与火鸡以及家鸭基因形成一个独立的分支。将萧山鸡IL-18成熟蛋白序列插入pGEX-4T-2载体并在Ecoli中得到表达,获得45kD的GST-IL-18融合蛋白。经纯化后用于制备多克隆抗体。本研究对萧山鸡白细胞介素18的全长基因进行了克隆及表达,并对其分子进化进行了分析。为深入研究其功能奠定了基础。     

生鲜牛肉中金黄色葡萄球菌的检验

金黄色葡萄球菌中毒是常见的微生物性食物中毒之一,国家规定金黄色葡萄球菌可以在食品中限量存在。我们对延边地区某肉业有限公司加工生产的生鲜排酸牛肉按照国家标准GB4789.10-2010中的第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker 平板计数进行了检测。结果报告为每100mL（g）样品中金黄色葡萄球菌的最近似数。实验结果表明生鲜牛肉金黄色葡萄球菌含量符合国家标准。     

马传染性贫血病毒gp90蛋白的表达及其在诊断中的潜在应用

以质粒pVRCSV1.0-syn-gp90,利用PCR扩增马传染性贫血病毒外膜蛋白基因(gp90),构建了原核表达质粒pET-28a(+)-gp90,然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达并纯化该重组蛋白,ELISA和Westem blot证明马的阳性血清可以识别该重组蛋白.以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,测定的效价为1:13,000.     

人内脂素的原核表达和分离纯化

目的:构建Visfatin原核表达质粒,诱导表达并纯化重组人内脂素(Visfatin)。方法:从人LO2细胞中提取总RNA后,经RT-PCR法得到人Visfatin的c DNA序列,用以构建带HIS标签的Visfatin重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni柱亲和层析纯化融合蛋白。结果:PCR扩增出的目的基因片段为1600 bp左右,与理论大小一致。SDS-PAGE、Western blot、质谱分析数据证明了蛋白是Visfatin融合蛋白。结论:成功的表达并纯化得到带HIS标签的Visfatin融合蛋白。     

人Dcp2基因克隆表达、多克隆抗体的制备及其应用

mRNA在细胞质内的稳定性是调控基因表达的重要方式。细胞以mRNA降解的方式对过时的、突变有害的mRNA进行及时清除以保证基因的正确表达和细胞正常的生命活动。其中脱帽酶Dcp1/Dcp2在mRNA降解中起到主要作用，但对其降解mRNA的详细作用机制了解甚少。到目前为止，尚没有该基因市售的抗体出现，阻碍了对该基因机理的研究。本文目的是利用PCR方法，从人的胎肝文库中克隆到Dcp2基因，制备其多克隆抗体血清。实验结果显示，通过溴化氰偶联柱子对该多克隆抗体血清经纯化得到的多克隆抗体，用于Western Blotting 试验，可以检测到该蛋白内源性的表达；用于激光共聚焦定位实验显示该内源性蛋白定位在细胞核内；此抗体同时可用于免疫沉淀实验。因此Dcp2基因和多克隆抗体的获得，为进一步研究该基因的功能创造了条件。     

抗人B7-2单链抗体基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

在成功建立稳定分泌鼠抗人B7-2杂交瘤细胞株基础上,扩增并克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人B7-2单链抗体(B7-2 ScFv)基因。为便于表达产物的纯化,在抗人B7-2 ScFv的C端增加了6×His tag序列。将其克隆至表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行原核表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,抗人B7-2 ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)菌中获得表达,重组融合蛋白的相对分子量约为43 kD,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经溶解包涵体,体外复性和Ni-NTA亲和柱纯化,获得了高纯度的抗人B7-2 ScFv,纯化蛋白得率约16.2%。成果为抗人B7-2单链抗体的生物学活性研究和抗肿瘤药物开发奠定了基础。     

肺炎衣原体膜表面蛋白重组质粒的构建

目的 构建表达肺炎衣原体膜表面蛋白(OMP)的重组质粒，并在火肠杆菌中表达获得基因重组蛋白．方法用高保真PCR方法从肺炎衣原体扩增OMP片段．双酶切后插入原核表达质粒pQE-30，在大肠杆菌M15中表达，结果重组质粒经双酶切鉴定与目的基因长度相符；各表达蛋白经SDS-PAGE分析，相对分子量与文献相符．结论该重组质粒可用于核酸疫苗的备选质粒，基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于肺炎衣原体检测试剂盒的制备。     

肠毒素蛋白结构改造与其抗肿瘤力

利用基因工程技术,进行肠毒素蛋白质结构改造,并以基因工程大肠杆菌进行表达和纯化,对纯化分离的改造体蛋白进行抗肿瘤活性分析。结果表明,本研究成功获得了肠毒素改构体蛋白,纯度大于98%,与改造前比该改构蛋白的毒性明显降低,抗肿瘤活性明显提高,提示肠毒素蛋白可能作为抗肿瘤新型药物。     

重组链球菌溶血素(SLO)的原核表达、纯化

目的构建SLO原核表达质粒,重组蛋白的诱导表达并纯化。方法提取链霉菌溶血素O模板DNA,PCR法扩增slo基因。构建融合表达重组质粒p GEX-6p-1-slo和pet32a-tev-slo,将正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21-DE3,使用异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白。采用亲和层析纯化重组蛋白,切除标签后,再通过亲和层析纯化,获取SLO重组蛋白。结果 PCR扩增出slo基因,基因片段(1700 bp)与理论一致。经SDSPAGE,蛋白质印迹显示重组蛋白相对分子质量为55 k Da,与数据库中的相对分子质量结果相符。结论成功构建了slo原核表达质粒,表达并纯化了SLO重组蛋白。     

巴戟天乙醇粗提物的体外抗菌活性初步研究

目的:对巴戟天乙醇粗提物的体外抗菌活性进行初步研究。方法:采用超声法提取,得到巴戟天浸膏,利用滤纸片法,二倍稀释法分别检测MIC和MBC,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及白色念珠菌等常见细菌及真菌进行体外抗菌活性初步探讨。结果:巴戟天乙醇粗提物对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌都有不同程度的抑菌及杀菌作用,最小抑菌浓度(MIC)分别为0.125g/m L,0.25g/m L,0.5g/m L,0.125g/m L;最小杀菌浓度(MBC)分别为0.5g/m L,1g/m L,1g/m L,0.25g/m L。结论:巴戟天乙醇粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及白色念珠菌均具有抑菌作用,并在一定浓度范围中具有杀菌作用。     

人甲胎蛋白基因的克隆和表达

目的 构建表达人甲胎蛋白(AFP)的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法 用PCR方法从人胎肝组织中扩增AFP基因片断，将其转入原核载体质粒pCEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在BL21DE3中表达。结果 重组质粒pCEMEX-AFP的AFP基因序列经分析与GenRank公布序列相符，各表达的蛋白经Western Blot检测有抗原性。结论 基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效的肿瘤抗原。     

检测免疫动物血清抗体中和试验

l、动物被动免疫这里既是利用生物药品厂生产的抗原物质疫苗、菌苗免疫动物注射等到一定时间动物机体产生特异性抗体，这种抗体往往可以从血液中分离提取即血清或血浆，在体外一定的pH值，温度，电解质，振荡，杂质等因素的作用下与相应的毒素，病毒受体结合而使病毒毒素失去毒性和感染力，其中中和试验(MNT)中活性抗体主要是1gG、1gM等，在将抗原抗体结合物注射到动物体内不能致死动物，证明该疫苗、菌苗能使机体产生对抗特异性细菌、病毒的抗体物质，而说明生物药品有效。2、应用该试验对校菌苗进行效力试验尤其是多联菌苗更显节约成本缩短检验时间，可改用小动物检验，较为准确简便、科学易行，易于了解菌苗、疫苗质量高低及其变化等诸多优点。     

IL-18-GPI融合蛋白的表达及其免疫增强作用的研究

目的:构建真核表达IL-18-GPI融合基因的表达载体,观察融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达动力学及生物学活性,为进一步研究细胞因子作为免疫增强剂在临床肿瘤治疗中的应用奠定基础.方法:通过RT-PCR的方法从脂多糖刺激的外周血淋巴细胞中钓取IL-18基因,通过共用限制性酶切位点与GPI相连形成pcDNA-IL-18-GPI真核表达质粒.将质粒转染CHO细胞后建立稳定表达融合蛋白的细胞株用于融合蛋白的提取.对提取纯化的蛋白进行生物学特性、蛋白质转移分析和γ-IFN诱导实验.结果:获得714 bp的核酸序列并构建重组质粒pcDNA-IL-18-GPI.SDS-PAGE和West-blot显示在CHO细胞中表达的IL-18-GPI融合蛋白分子量约为27.5 kD,该蛋白具有明显的蛋白转移和诱生γ-IFN的作用.结论:IL-18-GPI融合蛋白是一种潜在的肿瘤疫苗增强剂,具有良好的应用前景.     

土壤中金黄色葡萄球菌分离实验改进

目的:从土壤中分离金黄色葡萄球菌。方法:选择性培养基平板涂布分离法。结果:分离到的菌株经菌落鉴定、革兰氏染色和形态鉴定以及金黄色葡萄球菌测试卡鉴定,都符合金黄色葡萄球菌特征。结论:所采用从土壤中分离微生物的方法快速,简便,可靠,可在教学中推广应用。