人Dcp2基因克隆表达、多克隆抗体的制备及其应用

mRNA在细胞质内的稳定性是调控基因表达的重要方式。细胞以mRNA降解的方式对过时的、突变有害的mRNA进行及时清除以保证基因的正确表达和细胞正常的生命活动。其中脱帽酶Dcp1/Dcp2在mRNA降解中起到主要作用,但对其降解mRNA的详细作用机制了解甚少。到目前为止,尚没有该基因市售的抗体出现,阻碍了对该基因机理的研究。本文目的是利用PCR方法,从人的胎肝文库中克隆到Dcp2基因,制备其多克隆抗体血清。实验结果显示,通过溴化氰偶联柱子对该多克隆抗体血清经纯化得到的多克隆抗体,用于Western Blotting 试验,可以检测到该蛋白内源性的表达;用于激光共聚焦定位实验显示该内源性蛋白定位在细胞核内;此抗体同时可用于免疫沉淀实验。因此Dcp2基因和多克隆抗体的获得,为进一步研究该基因的功能创造了条件。     

商陆扩展蛋白基因PaEXP1在逆境胁迫下的表达

利用同源克隆的方法,从商陆中克隆得到扩展蛋白基因的全长cDNA序列,命名为PaEXP1(GenBank 登录号为GQ851947).PaEXP1长1128bp,含有759bp的完整开放阅读框,编码252个氨基酸,分子量27.1kD,等电点8.55.PaEXP1氨基酸序列N端含有8个半胱氨酸残基,1个组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)域,C末端存在4个保守的色氨酸残基,具有扩展蛋白的典型结构.系统进化树分析表明,PaEXP1属于扩展蛋白的α-扩展蛋白家族.Real time-PCR结果表明,PaEXP1主要在根中表达,低温、盐、重金属和渗透胁迫均强烈地抑制其基因的表达.酵母转化实验表明,转PaEXP1可以提高酵母的平均直径,说明PaEXP1参与细胞壁的松弛扩展和细胞的增大过程.     

静力性负荷所致损伤对大鼠骨骼肌TGF-β1表达的影响

为探讨TGF-β1在骨骼肌静力性损伤后修复和再生过程中的作用机制,选用雄性SD大鼠72只,随机分为对照组、3天~4周实验组,对各实验组大鼠踝关节施加50%体重负荷进行后肢跖屈位支撑站立,造成腓肠肌静力性损伤。采用逆转录-聚合酶链反应和免疫组化方法,观察腓肠肌TGF-β1在转录和翻译水平的表达。结果:TGF-β1在转录和翻译水平的表达均显著增强,但转录水平表现为第3天~2周时升高,第3周时回落,至第4周时又急剧升高,而翻译水平表现为阳性面积在第1周时达到高峰,随后下降,而阳性灰度强度在第3天~2周时处于稳定水平,随后显著升高。结论:TGF-β1参与调节骨骼肌静力性损伤后的再生和修复,TGF-β1 mRNA表达上调在早期和中期主要是导致TGF-β1蛋白分布更加广泛,在后期主要是引起局部TGF-β1蛋白浓度的升高。     

商陆金属硫蛋白基因PaMT的表达分析

从商陆抑制性消减杂交文库中获得金属硫蛋白PaMT,基因全长141 bp,编码46个氨基酸,等电点和分子量分别为3.85和4.7 kD,具有12个半胱氨酸残基:具有典型的金属硫蛋白结构(CXC结构). 进化树和蛋白结构分析表明它属于金属硫蛋白家族. PaMT主要在根中表达,且受重金属胁迫上调其基因表达. 蛋白融合表达表明,PaMT可以提高大肠杆菌对重金属离子的耐受力.     

中等强度运动大鼠左室肌蛋白质组差异表达

目的:采用蛋白质组学技术,探究中等强度运动后大鼠左室肌蛋白质组的差异表达。方法:将SD大鼠分为运动组和对照组,训练完成后麻醉处死,计量大鼠心重,提取左室肌全蛋白样品,采用2-DE进行分离,选择运动后差异表达量≥10倍的备选目标蛋白点,进行质谱鉴定。结果:取5个目标蛋白点,经质谱鉴定4个。未知蛋白质训练后表达量下调≥12.5倍。结论:1)中等强度运动后,大鼠心脏发生形态学变化使心肌增厚,心收缩力增强;2)训练组大鼠在长期运动训练中,左心室心肌蛋白质组变化显著;3)鉴定出运动医学中还未涉及的4种蛋白质,分别是三磷酸腺苷合酶偶合因子6(CF6)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、烯酰辅酶A水合酶(ECH)和ATP合酶α亚基(ATP synthase subunit alpha),其表达发生的顺应性改变说明,中等强度运动可提高心肌的能量代谢水平。     

串联亲和纯化技术筛选hCLP46 的相互作用蛋白

hCLP46(human CAP10-like protein46)是从MDS-AML患者的CD34⁺干细胞cDNA文库中筛选出的基因.我们利用串联亲和纯化技术来筛选与hCLP46有相互作用的蛋白.通过体内交联-甘氨酸洗脱策略,检测到7条有差异的蛋白带,经液相色谱-质谱联用鉴定,得到了CNX和PDI等一系列内质网伴侣蛋白.所以hCLP46可能是一个糖蛋白,其成熟过程利用了BiP/Grp94 和CNX/CRT 2套伴侣蛋白系统.     

人类珠蛋白基因

珠蛋白是组成血红蛋白亚基的肽链.人类珠蛋白可分为两类,即α类和β类.α和β类又分别有2种和5种不同的珠蛋白.它们由各自的基因所编码.珠蛋白基因是典型的真核基因.它们分别位于第11号和第16号染色体上.这些基因在细胞分化的过程中通过脱甲基化作用,使基因的启动子等调控序列与特定的蛋白因子作用而使基因活化,转录合成相应的珠蛋白.     

早期氢水和运动干预对心梗心脏β3-AR表征研究

摘要：目的：探讨早期氢水和有氧运动干预对心肌梗死大鼠左心室β3-AR及其下游分子eNOS蛋白表达的影响。方法: 雄性SD大鼠随机分为假手术组(S)、心肌梗死组(MI)、有氧运动+心梗组(EM)、氢水+心梗组(HM)和氢水+有氧运动+心梗组(HEM)。HM和HEM组大鼠均给予早期氢水灌胃4 mL,灌胃时间5 d/周×3周。EM和HEM组大鼠均进行早期3周递增式跑台运动。第1周适应性训练,时间20 min/d,速度15 m/min;第2周运动时间为25～30 min/d,速度为27～30 m/min;第3周运动时间为60 min/d,速度为30 m/min,5 d/周×3周。3周氢水及运动干预后MI,EM,HM和HEM组大鼠均结扎心脏左冠状动脉前降支,建立MI模型。S组大鼠实施假手术。5组大鼠术后45 min测定血流动力学指标判定心功能变化。心脏Masson染色测定胶原容积百分比(CVF)。采用荧光免疫组化法检测左心室β3-AR蛋白表达。采用western blot法检测β3-AR及下游eNOS蛋白水平。结果: MI后心脏CVF值显著升高(P<0.01),心功能显著降低,同时左心室β3-AR蛋白表达有增加趋势。与MI组比较,EM、HM和HEM组CVF(P<0.01)均显著降低,心功能均得到提升。EM、HM和HEM组均可见左心室β3-AR阳性染色,同时EM和HM组β3-AR和eNOS蛋白表达均较MI组显著增加(均P<0.05),HEM组β3-AR和eNOS表达较MI组有增加趋势。且左心室β3-AR与eNOS蛋白表达呈显著正相关(R=0.47, P<0.01)。结论: 心梗之前进行3周氢水和运动干预可减轻心肌纤维化程度,提升心梗大鼠心功能,增加左心室β3-AR表达,上调其下游eNOS蛋白表达。氢水联合运动干预对β3-AR影响并不及单一干预效果。而3种干预方式对心功能提升并无差异。     

运动对胰岛素抵抗模型大鼠骨骼肌GLUT4和PKBβmRNA表达的影响

目的:观察运动对胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)模型大鼠胰岛素信号转导途径中的关键蛋白GLUT4(葡萄糖转运蛋4)和PKBβ(蛋白激酶Bβ)表达变化的影响。方法:将健康Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、运动组及饮食干预组,每组8只。采用高脂膳食喂养建立IR大鼠模型,分别以游泳运动和改饲普通饲料干预4周;测算胰岛素敏感性指数(ISI);应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对各组大鼠骨骼肌细胞GLUT4和PKBβmRNA表达进行观测和定量分析。结果:运动显著提高IR模型大鼠ISI(P<0.05),运动可以使IR大鼠胰岛素信号转导途径中GLUT4(P<0.01)和PKBβ(P<0.01)表达增强。结论:运动促进了胰岛素PI3-K/PKB途径信号通路中GLUT4的转位,具有改善IR的作用。     

运动和雌二醇对去卵巢大鼠GSK-3β蛋白表达的影响

摘要：目的：建立一去卵巢大鼠模型,通过运动和体外补充雌激素,探讨运动和雌激素对去卵巢大鼠脂肪代谢中GSK-3β、P-GSK-3β的影响。方法：以雌性去卵巢SD大鼠为研究对象,进行为期15周的实验,随机分为假手术安静组(Sham)、假手术运动组(Sham+E)、去卵巢安静组(OVX)、去卵巢运动组(OVX+E)和去卵巢雌激素组(OVX+E2)。运动组大鼠18m/min,坡度5°,45min/d,每周运动5d;去卵巢激素组大鼠每周按体重25μg/kg注射E2,每周3次。实验结束后测定大鼠腹腔内脂肪重量,采用放射免疫方法测血清中雌激素E2水平,WesternBlot测定大鼠脂肪总蛋白含量和脂肪组织GSK-3β和P-GSK-3β蛋白表达。结果：1)经过15周实验后,去卵巢安静组大鼠体重显著高于假手术安静组(P<0.05),运动和补充雌激素之后体重明显下降(P<0.05);2)去卵巢安静组大鼠腹腔内脂肪重量最大,运动和雌激素补充干预后脂肪重量明显降低(P<0.05);3)大鼠去卵巢之后脂肪组织中甘油三酯含量显著升高(P<0.05),运动和补充雌激素后又显著下降(P<0.05);4)运动训练后,假手术运动组大鼠和去卵巢运动组大鼠脂肪组织P-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。结论：1)运动训练和体外补充雌激素,在一定程度上可以缓解去卵巢大鼠腹腔内脂肪的积累;2)中等强度运动训练能够提高去卵巢大鼠体内雌激素水平;3)运动能够上调脂肪组织中P-GSK-3β/GSK-3β蛋白的表达;体外补充雌激素对P-GSK-3β/GSK-3β蛋白的表达却无明显影响。     

镉诱导牛蛙金属硫蛋白的制备及纯化

用不同浓度的CdCl2腹腔注射牛蛙,诱导其产生金属硫蛋白,经PEG-6000浓缩,SephadexG-50柱层析纯化后,用SDS-PAGE低分子量凝胶电泳检测MT分子量.结果表明,最佳诱导浓度为100mg.kg^-1;紫外分光光度法测定其蛋白含量为0.502mg.g^-1,该蛋白在254nm处有一明显特征吸收峰;测得MT分子量约为10KD.证明所用方法可制备较纯的金属硫蛋白抗原且简便可行.     

耐力运动与高脂饮食对Wistar大鼠骨骼肌线粒体融合分裂蛋白表达的影响研究

目的:观察耐力运动与高脂饮食干预对肥胖大鼠骨骼肌线粒体融合与分裂蛋白表达的影响。方法:48只Wistar大鼠分N组(16只)与H组(32只)普食/高脂饲喂造模8周,随后分为NNC组、NNE组、HHC组、HHE组、HNC组与HNE组,NNC组、NNE组、HNC组与HNE组使用普食饲喂9周,HHC组与HHE组继续使用高脂饲喂9周,NNE组、HHE组与HNE组进行9周耐力运动干预。结果:高脂饲喂后大鼠骨骼肌线粒体融合蛋白MFN1、MFN2表达减少,分裂蛋白FIS1表达增加,耐力运动干预增加了高脂饲喂后大鼠骨骼肌线粒体MFN1、MFN2的表达,降低了DRP1、FIS1的表达。结论:高脂饲喂显著降低了骨骼肌线粒体融合蛋白的表达,增加了分裂蛋白的表达,耐力运动干预显著增加了骨骼肌线粒体融合蛋白的表达,显著降低了HFD干预后骨骼肌线粒体分裂蛋白的表达。     

PI3K/Akt/GSK-3β在去负荷及再负荷大鼠腓肠肌蛋白代谢中的作用

目的:观察去负荷及再负荷过程PI3K/Akt/GSK-3β信号途径的变化,并探讨该过程对骨骼肌蛋白分解及合成代谢的影响。研究方法:24只雌性SD大鼠随机分对照组(NC)、去负荷14 d模型组(TS)、去负荷14 d+再负荷自由活动14 d组(NR)、去负荷14 d+再负荷离心运动14 d组(ER)。用免疫印迹半定量分析PI3K、Akt、GSK-3β和P-GSK-3β的表达。研究结果:与NC组相比,TS组腓肠肌总蛋白含量显著下降(P<0.05);以不同方式再负荷14 d都能使腓肠肌蛋白含量提高,NR与ER组之间没有显著差异;ER组PI3K蛋白表达显著高于NR组(P<0.05);ER组Akt也高于NR组,但没有显著性差异。ER组的P-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达与NR组的相似趋势,其中ER组的P-GSK-3β与NC组相比,有显著性差异(P<0.05);而GSK3β则显著增加(P<0.05)。结论:在去负荷条件下,PI3K/Akt/GSK-3β信号对骨骼肌蛋白分解影响较小;再负荷条件下,离心运动能加强PI3K/Akt/GSK-3β信号作用,参与骨骼肌蛋白合成。     

顺乌头酸酶AtACO3参与调控Zn稳态的研究

从拟南芥中克隆得到AtACO3基因的全长cDNA序列. 半定量PCR实验结果表明,200 μmol/L CuCl₂处理能明显抑制该基因的表达,而200 μmol/L ZnCl₂处理1 h则可显著促进其表达. 为验证AtACO3蛋白N端的功能,构建AtACO3 5'端1632 bp基因片段的原核表达载体pET30a-AtACO3-N,并转化大肠杆菌. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,该基因片段可以在大肠杆菌中稳定表达. 进一步的抗性实验表明,异源表达基因AtACO3的N端序列能提高大肠杆菌的Zn²⁺耐受性.     

商陆寡肽转运蛋白基因PaOPT的 cDNA全序列克隆及表达分析

从垂序商陆(Phytolacca americana)的重金属镉胁迫下商陆幼苗叶片的正反向抑制性消减杂交文库(SSH文库)中,获得商陆寡肽转运蛋白基因的EST序列. 利用RACE的方法克隆到该基因的全序列cDNA(PaOPT,GenBank注册HQ647015). PaOPT基因在进化中的地位分析表明:它可能属于OPT 3 基因家族. 利用实时荧光定量PCR的方法,分析PaOPT的组织表达特异性以及商陆种子成熟及萌发过程的表达模式. 结果表明,该基因是一个在种子中特异性表达的基因,预测它对植物的生长发育有着重要的作用.     

商陆小G蛋白激活蛋白基因 PaAGAP 在逆境下表达研究

利用同源克隆和RACE方法在商陆( Phytolacca acinosa )中得到一个推测的小G蛋白ArfGTPase激活蛋白 ArfGAP (ArfGTPase activating protein) 的全长cDNA序列 PaAGAP . PaAGAP 序列编码332个氨基酸.蛋白含有保守的锌指结构域(CX₂CX₁₆CX₂C类)和C2结构域.实时荧光定量PCR表明在寒、旱、盐和重金属的不同时间胁迫下,PaAGAP可以被诱导,表达量有不同程度的上调.由此推测 PaAGAP 可能是通过快速启动转录和翻译,使ARF失活,抑制植物生长素极性运输,来参与植物逆境反应的.     

运动对RBP4诱导的脂代谢异常鼠肝脏ACC1 表达和脂肪合成的影响

目的:研究运动对RBP4诱导的脂代谢异常鼠肝脏ACC1表达和脂肪合成的影响.方法:重组人RBP4注射建立脂代谢异常鼠模型.设一次性运动组(RBP4 One-time exercise group,ROE 组)、8周有氧运动组(RBP4 aerobic exercise group,RAE组)和安静对照组(RBP4 control group,RC组).结果:ROE组血清RBP4水平与RC组相比显著降低(P＜0.05),血清TG和肝脏TG含量无显著改变(P＞0.05).RAE组血清RBP4、TG和肝脏TG含量与RC组和ROE组相比均显著降低(P＜0.01).与RC组相比,ROE组和RAE组肝脏ACC1mRNA表达均显著降低(P＜0.01).与RC组相比,ROE组ACC1蛋白表达无显著改变(P＞0.05).与RC组和ROE组相比,RAE组ACC1蛋白表达均显著降低(P＜0.01).结论:高RBP4显著增加小鼠肝脏ACC1基因和蛋白表达增加,促进肝脏脂肪合成.8周有氧运动抑制了RBP4在肝脏的脂肪合成促进作用,改善脂代谢,机制涉及降低RBP4水平、减少肝脏ACC1基因和蛋白表达以及TG的合成.     

柞蚕抗菌蛋白的诱导及纯化

雄性柞蚕蛹经大肠杆菌诱导产生抗菌蛋白,该抗菌蛋白对大肠杆菌(Escherchia Coli)有抑菌作用。将有活性的柞蚕蛹血淋巴上柱(SephadexG—50)层析,经SDS—聚丙酰胺凝胶电泳检测,获得部分纯化的抗菌蛋白。     

印度芥菜重金属ATP酶基因的分离与表达

利用同源序列克隆技术在印度芥菜幼苗中分离出2个重金属ATP酶cDNA片段BjHMA 3 和BjHMA 4 ;实时荧光定量PCR表明BjHMA 3和BjHMA4 在所有的组织器官中均有表达,其中在根中表达量最高,叶片中表达量最少;重金属Zn或Cd胁迫均能增强二者在叶片中的表达,表明BjHMA不仅参与植物的生长发育过程,而且在重金属稳态和耐性中具有重要作用.     

基于DNA条形码技术甜瓜迷实蝇的分子鉴定

以口岸截获的甜瓜迷实蝇蛹和成虫作为研究对象,提取其基因组DNA,检索ITS2、COI、COII、CYTB基因引物,PCR扩增后产物用双脱氧法测序,结合Genebank中的相关数据,借助生物信息学分析软件验证甜瓜迷实蝇分子鉴定序列,构建NJ系统进化树,分析遗传进化关系,以获得更多甜瓜迷实蝇快速鉴定的分子数据.结果表明,从甜瓜迷实蝇蛹和成虫中获得的8条序列,仅有COI基因达到鉴定标准;ITS2、COII、CYT-B基因未达到鉴定标准,并非数据质量不合格,而是NCBI数据库相关数据不足.由于研究扩增模板相同,此类序列为新发掘的甜瓜迷实蝇的序列,从NJ系统进化树聚类分析可以看出,这些序列均可作为甜瓜迷实蝇分子鉴定序列.