柔嫩艾美耳球虫(广东株)子孢子折光体抗原p28基因的分析

将克隆的柔嫩艾美耳球虫广东株p28基因与柔嫩艾美耳球虫MerckstrainLS18株的折光体抗原p28基因和USDA－APIno．24株折光体抗原GX3262基因进行了序列比较．发现广东株和MerckstrainLS18株的折光体抗原核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99．9％和100％，且基因内富含AGC重复顺序；而GX3262的基因序列为P28基因C-端的组成部分，并无特别的疏水和亲水区．     

昆虫杆状病毒在生物技术研究中的应用

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入，昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体，在昆虫细胞和虫体内表达外源基因，形成了昆虫杆状病毒载体表达系统，利用杆状病毒携带外源基因，通过同源重组将外源基因导入到家蚕的基因组构建了转基因家蚕；通过向杆状病毒基因组中插入毒素、激素、酶抑制剂等的基因或从杆状病毒基因组中删除某个基因，或通过不同杆状病毒间的杂交，使子代病毒的宿主域扩大，从而提高了杆状病毒作为生物杀虫剂的杀虫效果。本文对杆状病毒在上述几个方面的应用进行了简要综述。     

应用昆虫杆状病毒系统高效表达外源基因

昆虫杆状病毒表达系统于1983年建立，迄今已有近千种外源基因在该系统中获得高效表达。本文对杆状病毒载体表达系统的原理、特点及近年来的发展与应用等作一综述。     

应用昆虫秆状病毒系统高效表达外源基因

昆虫杆状病毒表达系统于1983年建立,迄今已有近千种外源基因在该系统中获得高效表达.本文对杆状病毒载体表达系统的原理、特点及近年来的发展与应用等作一综述.     

用于表达多肽抗原融合基因的杆状病毒系统

以含翻译起始密码子ATG的质粒pSⅪⅤⅥ Ⅹ3/4为转移载体,将多角体蛋白及切除部分5′和3′端的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)基因同时插入粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)基因组中,构建了形成多角体的重组毒株。该毒株能利用合成—多角体ⅪⅤ串联启动子,表达由截短的HBcAg序列及其上下游多接头与杆状病毒DNA部分序列组成的融合蛋白基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Wcstern印迹与免疫电镜观察的结果表明,融合蛋白基因表达产物的分子量约20.5KD,与理论计算值相符,并保留了HBcAg的抗原性,亦能形成典型的HBcAg颗粒。组建含多克隆点及截去两端序列的HBcAg基因转移载体质粒,使编码多肽抗原的寡聚核苷酸易于克隆,以HBcAg融合蛋白方式在杆状病毒载体系统中表达,并能形成HBcAg为蛋白载体的抗原颗粒结构。     

猪干扰素基因的克隆与原核表达载体的构建

干扰素(Interferon)是一种广谱抗病毒剂,具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种作用而被广泛应用于病毒性疾病的预防和治疗。本实验以猪肝脏组织为材料,提取猪肝脏组织DNA,根据Gen Bank收录的猪干扰素基因序列设计特异性引物,以猪肝脏DNA为模板进行高保真扩增得到IFN基因的ORF片段,然后进行了T载体克隆。再利用引入Eco RⅠ、SalⅠ酶切位点的特异性引物对IFN成熟肽段的基因进行亚克隆,经双酶切、连接、转化后,成功构建了p ET28a-ifn原核表达重组质粒,为干扰素基因的原核表达奠定了基础。     

抗菌肽P113多拷贝表达载体的构建

目的:构建唾液抗菌肽P113基因多拷贝串联重组体,并将其克隆到表达载体pET-28a.方法:根据大肠杆菌偏爱的密码子设计并合成人唾液抗菌肽P113基因,采用PCR技术构建P113基因的自融合多拷贝串联重组体polyP113,BAMH I和HindⅢ双酶切表达载体pET-28a和polyP113基因,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性菌落,PCR、酶切、测序鉴定重组质粒.结果:所构建的含有十拷贝P113基因的重组体正确克隆到表达载体pET-28a上,无突变.结论:成功构建含十拷贝唾液抗菌肽P113基因表达框的大肠杆菌表达载体.     

反义bcl-2逆转录病毒表达载体的构建

凋亡是一种不同于坏死且受基因控制的主动性细胞自我消亡过程,亦是许多抗癌药物作用的主要机理之一。Bcl-2是一种凋亡负控制的重要基因,其蛋白产物能抑制细胞的凋亡或程序性细胞死亡过程。我们构建了反义bcl-2逆转录病毒表达载体导入多发性骨髓瘤细胞株来调节Bcl-2基因表达,从而诱导细胞凋亡或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性,来探讨与多发些骨髓瘤的关系。     

柔嫩艾美耳球虫合肥(HF)株的分离与鉴定

取具有球虫病典型症状的病鸡盲肠内容物,用离心沉浮法收集鸡球虫卵囊,加入适量的2．5％重铬酸钾溶液,置于27℃恒温箱中培养,定时观察卵囊的发育情况,并测量卵囊的大小,再结合病鸡的临床症状和病理变化,初步鉴定为柔嫩艾关耳球虫。为获得纯种柔嫩艾美耳球虫,采用改进的单卵囊分离技术进行分离。即用2％琼脂块分离到单个卵囊后,制成单卵囊胶囊,进行雏鸡单卵囊胶囊人工感染试验,然后将收集到的柔嫩艾美耳球虫进行无球虫鸡体增殖。测量增殖后两代卵囊的大小,卵形指数等形态指标, 并进行差异显著性检验(F检验),结果差异不显著,而且第二代球虫的寄生部位和病理变化与第一代相同,鉴定分离出的球虫为柔嫩艾美耳球虫,暂定为柔嫩艾关耳球虫合肥(HF)株。     

甘蔗SPSⅢ基因启动子5’侧翼缺失的GUS表达载体构建

蔗糖磷酸合成酶是调节植物蔗糖合成的关键酶之一。本研究根据该段序列上预测的顺式作用元件将SPSⅢ5＇侧翼序列不同长度的片段与GUS基因融合,成功构建了3个缺失表达载体,为进一步的甘蔗SPSⅢ启动子活性区域鉴定提供基础。     

鲑鱼生长激素基因酵母分泌表达质粒构建

用ＰＣＲ方法改造鲑鱼生长激素（ＧＨ）ｃＤＮＡ,在成熟蛋白编码序列５′端前加入ＥｃｏＲⅠ位点,改造后的ｃＤＮＡ通过平端连接插入质粒ＹＥＰＭ０４,使鲑鱼ＧＨ基因置于酵母ＭＦα１因子分泌肽前导序列后、并在ＭＦα启动子调控之下,成为大肠杆菌酵母穿梭质粒ＹＥＰＭ０４ｆＧＨ．重组子酶切分析表明,鲑鱼ＧＨ基因正向插入质粒ＹＥＰＭ０４的ＭＦα启动子和分泌肽序列之后     

水平基因转移与物种演化

遗传学、基因组学和生物信息学业已证明，由病毒、类病毒、质粒等介导的细胞、个体和物种之间的水平基因转移广泛地存在于细菌、古生菌和真核生物中，水平基因转移可能造成同一生境中物种分化的抑制，种群的快速协同进化，不同物种的趋同进化、返祖遗传、获得性状(基因)遗传和家族成员的性状趋同等。因此，水平基因转移是物种进化的一个重要驱动力。     

物理方法介导基因转移的研究进展

对转基因常用的物理方法进行系统的介绍,包括各种基因转化技术产生的生物效应、转基因的基本原理和影响因素等。重点综述超声波介导法、激光微束导入法、基因枪轰击法,并对物理方法转基因进行综合评价和技术应用展望。     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30原核表达载体构建

苦瓜作为药食同源的植物,含有许多活性成分,其中核糖体失活蛋白MAP30是近年来研究较多的一种.根据G enbank中MAP30序列,采用PCR技术,从苦瓜基因组DNA中扩增出该基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-MAP30,经克隆载体转化菌液PCR鉴定,结果显示成功构建MAP30的原核表达载体.     

含LEG工程质粒的构建及其转化甘蓝的研究

将pUC18-leg质粒上的野豌豆贮藏蛋白基因(leg)与pBR325的氯霉素抗性(Cm)基因连接在一起,构建出中间载体pJG9,通过三亲交配技术,将大肠杆菌中的pJG9转移至含pGV3850的农杆菌中,并选出含整合质粒的农杆菌.利用类似叶盘转化法的方法,将pGV3850上的外源基因转入甘蓝中,在含Cm15/μg/ml和先锋霉素500μg/ml的培养基上,选择愈伤组织并由此再生出转化植株,并得到胭脂碱测定和DNA分子杂交的证实.     

核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及hpRNAi载体的构建

多聚半乳糖醛酸酶是核盘菌致病力发挥作用的关键酶。本研究用PCR的方法从核盘菌基因组DNA中扩增出多聚半乳糖醛酸酶（PG5）基因片段,再以扩增出的PG5基因片段作为模板设计引物扩增出一个相应较小的片段。将两个PG5基因片段反向插入到植物表达载体2300 sn的35S启动子和nos终止子之间,构建出可转录表达出发夹RNA结构的组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰抗菌核病的基因工程研究奠定了基础。     

水稻多顺反子质体表达载体的构建

根据发表的水稻叶绿体基因组序列，对比烟草高频同源重组目标区(NCBI编号：X15901)设计引物，用PCR的方法克隆到一段3．939kb叶绿体DNA片段，命名为crDNA．以其作为外源基因定点整合的同源重组片段，以来自烟草叶绿体的强启动子Prm、甘露聚糖酶man、绿荧光蛋白gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA和终止子psbA3’，构建水稻质体多顺反子表达载体pLM3(-psbCPrm—SD-man—SD-gfp-SD-aa-dA—psbA3’-tmm-)．并在大肠杆菌中通过平板定性对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定，结果表明：在大肠杆菌中，多顺反子盒式表达结构中的三个基因(man，gfp，aadA)均得到了表达．     

绿僵菌Argonaute基因片段原核表达载体的构建及其表达

绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌.研究表明小RNA能够调控基因的表达,其中Argonaute基因在整个小RNA通路中发挥重要的作用.本研究通过RT-PCR的方法从绿僵菌中获得了Argonaute基因的部分功能片段,构建了其重组原核表达载体,将重组载体转化至大肠杆菌进行诱导表达;采用镍柱亲和纯化重组的目的蛋白并通过Western blot技术鉴定.结果发现：通过RT-PCR的方法获得长度约为950bp的基因片段;重组原核表达载体经诱导表达后,SDS-PAGE检测发现分子量约为34kDa的目的蛋白条带;诱导5h后蛋白的表达量最高,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,经Western blot技术检测,重组蛋白可与His-tag抗体发生特异性反应.该纯化重组蛋白的获得为将来绿僵菌Argonaute蛋白抗体的制备,并进一步通过该抗体获得绿僵菌体内的小RNA及其靶基因提供了基础.     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白Vp28基因的克隆、表达及蛋白纯化

以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶（SmaI,Not I）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白．