鸡肾型传染性支气管炎病毒适应于鸡胚肾细胞的研究

将经过系统鉴定的2株鸡肾型传染性支气管炎病毒(NIBV)在鸡胚肾细胞上盲传7代后,均可不同程度的产生特征性细胞病变效应(CPE),表现为细胞膜界限消失及多核巨细胞的形成,并通过间接免疫荧光抗体染色法,免疫复合物电镜观察及姬姆萨染色法对CEK适应毒进行鉴定,结果表明2株NIBV鸡胚适应毒经多次传代后均适应于CFK细胞.     

禽腺病毒4型(FAdV-4)分离株对鸡的致病力及其基因组分析（英文）

目的:了解禽腺病毒4型(FAd V-4)分离株在口服、滴鼻点眼和肌注三种感染途径下对7～35日龄鸡的致病性,并分析该分离株与其他参考毒株在基因组水平上的差异。创新点:用原代鸡胚肾细胞(CEK)成功培养了FAd V-4分离株。发现除了常用的口服和肌注途径,FAd V-4也可通过滴鼻点眼接种途径感染7、21和35日龄鸡。肌注方法最为敏感,导致感染鸡100%死亡;35日龄鸡较7和21日龄鸡表现出更明显的临床症状和剖检病变。方法:通过口服、滴鼻点眼和肌注三种途径将FAd V-4分离株的CEK细胞培养物接种7～35日龄的无特定病原体(SPF)鸡。通过临床症状观察、排毒检测、病理解剖、免疫组化和组织中毒载量测定来判断分离株的致病性及病毒在组织脏器中的分布情况。通过病毒中和试验检测感染存活鸡的血清中和抗体。通过全基因组测序分析,比较FAd V-4分离株与国内外参考毒株的基因组序列差异。结论:本研究分离鉴定的FAd V-4分离株SD1511可以在CEK细胞上适应,并可以通过口服、滴鼻点眼和肌注三种感染途径引起7～35日龄的SPF鸡50%～100%的死亡,其中肌注最为敏感,死亡率达100%。感染鸡持续排毒至感染后的40天,产生具有明显中和作用的中和抗体。全基因组测序分析结果显示,SD1511基因组与最近国内分离的FAd V-4具有很高的同源性,但与国外的分离株有明显的差异。     

鸽I型副粘病毒的毒价测定

鸽I型副粘病毒(PPMV-I)JS株的尿囊液毒，经10倍连续稀释后分别接种鸡成纤维细胞和非免疫鸡胚，测定其半数细胞培养感染量(TCID50)和鸡胚半数感染(EID50)。结果显示，JS株TCID50为10^-9.33／0．1mL，EID50为10^-9.375／0．1mL，表明JS株病毒对鸡胚和鸡胚成纤维细胞的易感性相近。     

鸽Ⅰ型副粘病毒的毒价测定

鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-Ⅰ)JS株的尿囊液毒,经10倍连续稀释后分别接种鸡成纤维细胞和非免疫鸡胚,测定其半数细胞培养感染量(TCID50)和鸡胚半数感染量(EID50).结果显示,JS株TCID50为10-9.33/0.1mL,EID50为10-9.375/0.1mL,表明JS株病毒对鸡胚和鸡胚成纤维细胞的易感性相近.     

鸽I型副粘病毒的毒价测定

鸽I型副粘病毒 (PPMV Ⅰ )JS株的尿囊液毒 ,经 1 0倍连续稀释后分别接种鸡成纤维细胞和非免疫鸡胚 ,测定其半数细胞培养感染量 (TCID50 )和鸡胚半数感染量 (EID50 )。结果显示 ,JS株TCID50 为 1 0 - 9.33/0 .1mL ,EID50 为 1 0 - 9.375/0 .1mL ,表明JS株病毒对鸡胚和鸡胚成纤维细胞的易感性相近。     

鸡传染性法氏囊病病毒的提纯和鉴定

鸡传染性法氏囊炎患鸡的法氏囊病料,经氟三氯甲烷氟利昂作用去除杂蛋白,并经甘仙———酒石酸钾密度梯度离心进一步纯化;细胞适应毒在鸡胚成纤维细胞上出现明显细胞病变(CPE)后,经冻融,PEG沉淀等过程纯化。电镜观察,光密度测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的结果表明,得到了完整形态的鸡传染性法氏囊病病毒。     

鹅副粘病毒的分离与鉴定

采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病鹅群中分离到一株病毒。经HA与HI试验、血清中和接种鸡胚试验、病毒回归试验确认为鹅副粘病毒，并命名为WF00G株，参照新城疫病毒毒力的判定的标准及其方法，测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间（MDT）、1日龄鸡脑接种致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉内接种致病指数（IVPI）分别为44.8h、1.81和2.32，结果表明该分离株具有与新城疫病毒（NDV）速发型相类似的毒力，属强毒力毒株。     

鹅副粘病毒的分离与鉴定

采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病鹅群中分离到一株病毒。经HA与HI试验、血清中和接种鸡胚试验、病毒回归试验确认为鹅副粘病毒 ,并命名为WF0 0 G株。参照新城疫病毒毒力判定的标准及其方法 ,测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间 (MDT)、1日龄鸡脑接种致病指数 (ICPI)和 6周龄鸡静脉内接种致病指数 (IVPI)分别为 4 4 8h、1 81和 2 32 ,结果表明该分离株具有与新城疫病毒 (NDV)速发型相类似的毒力 ,属强毒力毒株。     

一道联赛试题的启示——细胞死活及种子生命力的鉴定方法

在很多竞赛模拟试题中出现:分别使用TTC和红墨水(酸性大红G)染色法对有活力的种子进行染色,预期的结果应该是() A.两者都能使胚完全染色 B.前者能使胚完全染色,后者不能让胚染色 C.两者都不能使胚完全染色 D.后者能使胚完全染色,前者不能使胚染色 尽管此题是2010和2008年江苏省中学生生物学联赛初赛理论试题,但是不难看出对种子的生命力及细胞死活的鉴定在中学生物学实践中的重要地位.为此,下面通过对种子生命力及细胞死活的鉴定方法作一些小结,以期对高中生物教学有所帮助.     

一例鸽新城疫病毒分离

1999年11月安阳某种鸽场饲养美国王鸽陆续出现死亡，为查清病因，我们用病死鸽进行细菌培养呈阴性，取脾脏病料接种SPF鸡胚分离到新城疫病毒，对病毒的部分特性进行测定，结果报告如下：1 材料与方法1.1 SPF鸡胚及SPF鸡山东家禽研究所提供，鸽由某鸽场提供。NDV、EDS-76病毒，禽流感病毒(AIVH9亚型)PMV-2血清均由中国农大动物医学院提供。1.2 病料处理取脾脏加适量灭菌PBS剪碎后用玻璃研磨器研磨，4℃8000r／min离心20min，取上清液经220nm针头滤器滤过后，即成脾悬液。1.3 鸡胚接种接种10日龄SPF鸡胚(尿囊腔途径0．2ml／枚)收集尿囊液进行HA和HI试验。     

试题精析（9）

1　试题一株纯黄粒玉米与一株纯白粒玉米相互授粉 ,比较这两个植株结出的种子的胚和胚乳细胞的基因型 ,其结果是 (　 )。A .胚的基因型不相同 ,胚乳细胞的相同B .胚的基因型相同 ,胚乳细胞的不相同C .胚和胚乳细胞的基因型都相同D .胚和胚乳细胞的基因型都不相同2　解题思路(1)玉米是雌雄 (单性花 )同株植物 ,雄花在植株顶端 ,雌花在植株中下部。所以纯合体的同一植株上产生的卵细胞、极核、花粉粒 (萌发成花粉管中的两个精子 )的基因组成都相同。(2 )根据第三章植物的个体发育知道 ,胚是由受精卵发育而来。胚乳是由受精极核发育而来 ,并…     

分子生物学技术检测鸡的沙门氏菌

鸡的沙门氏菌病(Salmonella sis avian)是由某些特定血清型的沙门氏菌(Salmonella)所引起的一类传染病的总称,对养鸡生产及食品卫生具有较大危害.然而,传统鉴定方法费时,使用范围窄,对专业技术人员经验依赖性强,通用性差.因此建立新的沙门氏菌的简便而且准确的鉴定方法对临床诊断和畜牧生产具有重要意义.本实验结合当今较先进的分子生物学技术建立了一个更为简便准确的鉴定方法.本实验先用C79-13型鸡白痢沙门氏菌对2日龄雏鸡进行攻毒实验,观察并记录现象.然后剖检病死雏,并按GB/T 4789.4-2003对心、肝、脾、肺、肾脏及肠道分离菌进行生化鉴定.挑选二十株生化鉴定为沙门氏菌属的单克隆菌落,克隆fliC基因并测序,NCBI数据库Blast比对.结果证明是由鸡白痢沙门氏菌C79-13攻毒导致雏鸡发病死亡.研究表明,利用PCR等分子生物学技术鉴定鸡沙门氏菌快速准确,在临床诊断和畜牧生产中有一定的应用和开发价值.     

抗鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体中和株的建立

将纯化IBDV组织毒免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA、病毒中和试验检测分泌抗体,获得了六株稳定分泌抗IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为NIB—1,NIB—2,NIB—3,NIB—4,NIB—5,NIB—6;六株单抗均具ELISA特性和免疫沉淀特性,亚类鉴定表明,前四株属于IgG_(2a),后二株属于IgG_1。杂交瘤细胞冻存六个月后复苏,均能稳定分泌特异性单克隆抗体。     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒(NDV)ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

病毒血凝及血凝抑制试验替代方法的研究

病毒血凝及血凝抑制试验是高等医学院校学生操作的一个基本试验,多年来一直采用流感病毒(或新城鸡瘟病毒)接种鸡胚后的尿囊液和鸡红细胞以及相应的抗病毒抗体来进行试验。此方法需要种蛋孵育、鸡胚接     

堆型艾美耳球虫卵囊的分离与纯化

用粗尼龙筛分离混合虫株，置2．5％重铬酸钾溶液，28℃—29℃恒温箱中培养，孢子化后接种鸡，7日后扑杀取小肠前段，经磨碎、孢子化、单卵囊鉴定、回归试验。第二次试验纯化后的孢子化卵囊，用2％琼脂溶液(60—70℃)包埋卵囊，待完全凝固后，在高倍显微镜下观察，用分离针、刀片分割琼脂球虫块至单个卵囊，再次接种鸡进行回归试验。直到纯化成堆型艾美耳球虫。     

大鼠骨骼肌细胞的原代培养及鉴定

探讨体外条件下骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化及鉴定的方法。取新生3～5 d的SD大鼠处死清洗后,采用Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶联合酶消化30 min,细胞悬液过滤离心后,用含有10%胎牛血清的培养液悬浮细胞,1 h后重新接种,重新接种2次,最后接种于L-多聚赖氨酸铺底的培养瓶中;采用骨骼肌肌动蛋白(α-sarcometric actin)免疫荧光方法鉴定骨骼肌细胞。肌卫星细胞培养5～6 h后开始贴壁,48 h完全贴壁,之后细胞进一步增多并相互融合,逐渐按一定方向呈有序排列。当细胞增殖至70%密度时,有融合趋势,加入分化培养基培养48 h后可形成多核的肌管,行免疫荧光染色,90%以上的细胞α-sarcometric actin染色阳性,证明培养的为骨骼肌细胞。     

人工感染鸡传染性喉气管炎的病理组织学观察

采用人工感染的方法诱发鸡传染性喉气管炎，注射含传染性喉气管炎病毒鸡胚尿囊液后3d发病，其发病率为95％，主要症状为呼吸困难、气喘、咳出血样渗出物，剖检以喉头气管有黄白色假膜为特征，受侵害的气管粘膜肿胀、出血，导致糜烂，以致鸡死亡，死亡率为25％。分别取病死鸡的气管、肺脏、心脏、肝脏、肾脏和脾脏，采用石蜡包埋，HE染色法，在显微镜下进行病理组织学观察。结果显示：实质器官为渗出性炎症；上皮细胞肿胀、变性、坏死、脱落和血液循环障碍。     

人工感染E．tenella鸡嗜酸性细胞的动态变化

80羽21日龄罗曼蛋公鸡随机分成试验与对照两组，研究雏鸡在21日龄人工感染E．tenella后第1、2、3、4、5、6、7、8天鸡嗜酸性细胞的动态变化。结果表明：感染E．tenella之后，试验组比对照组嗜酸性细胞明显增多，每日组间差异均极显著(P＜0．01)；在感染后第1—6天，试验组日间差异不显著(P＞0．05)，在感染后第6—7天，试验组日间差异极显著(P＜0．01)，而在感染后第7—8天日间差异显著(P＜0．05)。     

大鼠骨髓源内皮祖细胞分离和培养

目的:研究大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)分离、培养以及诱导向内皮细胞分化的方法。方法:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,经贴壁后定向诱导培养2周。以CD34、CD133、VEGFR-2、vWF免疫细胞化学、荧光染色法以及Dil-acLDL结合FITC-UEA-1双荧光染色法鉴定EPCs。结果:贴壁细胞经培养诱导后3d开始伸展,4~7 d形成细胞集落,10~21 d增殖加速呈典型的“鹅卵石“样外观,并出现条索状结构且呈“微血管样“排列生长。细胞免疫荧光染色鉴定CD34、CD133、VEGFR-2、vWF阳性,Dil-acLDL联合FITC-UEA-1双染阳性。结论:从大鼠骨髓中分离单个核细胞,体外诱导培养后可以表现出部分内皮细胞的特征。