花臭蛙线粒体DNA 12S及16S rRNA序列的测定

线粒体基因是动物起源进化及群体遗传分析的理想研究对象,其中的12S和16SrRNA这两个保守序列研究比较广泛。本文以花臭蛙(Odorrana schmackeri)为实验材料,采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取花臭蛙肌肉组织基因组DNA,并利用聚合酶链式反应(PCR)技术进行扩增得到线粒体上12S和16SrRNA的保守片段,采用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增产物进行检测,最后对两段基因序列进行测定并进一步分析,分别得到347bp和380bp的碱基序列。     

GST融合蛋白表达系统在实验教学中的应用

以GST-AQP7(Aquaporin 7)融合蛋白的原核表达为例,进行了生物学开放性实验教学的实践与探讨。利用PCR技术快速扩增小鼠AQP7-C末端亲水性肽段区基因片段,构建重组表达载体pGEX-4T-1∕AQP7,转化表达菌株E. coli BL21,诱导表达GST-AQP7融合蛋白,并对目的蛋白亲和层析纯化。PCR鉴定和DNA测序结果表明,pGEX-4T-1∕AQP7重组表达载体构建正确,SDS-PAGE蛋白电泳结果证实GST-AQP7高效表达并成功纯化。经过上述实验过程,学生系统掌握了从基因操作到蛋白表达一系列基本的分子生物学实验技能,很好地将课本所学理论知识应用于实验研究,提高了学生的综合科研素质,激发了学生的实验热情。     

猪源溶血性大肠杆菌fedA的克隆与表达

根据Imbereehts等报道的EHEC F18菌毛主要亚单位(fedA)基因序列设计一对引物，以重庆地区仔猪水肿病流行强毒株W96基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增到约500bp的核酸片段。用常规DNA重组技术将该片段克隆到表达载体pET28b( )的SalI-Hindm位点之间构建重组表达质粒pET28fedA，序列测定结果显示该克隆片段长447bp，同源性分析表明该基因片段与GenBank报道的fedA核苷酸序列有99．4％的同源性，W96株fedA基因三处核苷酸发生变异，其中两个为无义突变，另一个导致Q100R突变。将pET28fedA转入BL21(DE3)中进行诱导表达，经SDS—PAGE电泳检测上清存在约20KD的蛋白，6xHis affinity tag IMAC亲和层析显示该蛋白能被亲和纯化，说明是含有组氨酸标签的融合目的蛋白。     

以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体的构建及鉴定

饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功.     

拟南芥热激蛋白HSP70基因片段克隆实验体系的建立

以拟南芥为材料,对热激蛋白HSP70基因片段进行了克隆研究,获得了最佳的分子克隆实验体系．首先提取拟南芥总DNA,接着在热激蛋白HSP70编码区设计引物,扩增出HSP70编码区的片断,再将HSP70编码区的片断加上具有EcoRⅠ酶切位点双链的人工接头,通过EcoRⅠ对其进行酶切．再与经过EcoRⅠ酶切并已经去磷酸化的PUC19载体通过T4连接酶进行连接,然后将连接产物置人到感受态大肠杆菌细胞中（即转化）,并让这种细胞在含有Amp＋／IPTG／X—Gal的LB培养基上生长．挑取培养基上蓝白斑中的白斑,进行质粒DNA提取,通过酶切质粒DNA,从而初步判断目的片段已被克隆．     

Lumican 基因真核表达载体的构建及其对人子宫内膜癌细胞 HEC -1A 增殖的影响

目的：克隆人Lumican基因及构建Lumican基因真核表达载体并研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖的影响。方法：取人新鲜正常子宫内膜组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增Lumican基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建真核细胞表达载体pEGFP-N1-Lumican,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的Lumican基因通过脂质体介导下转染人子宫内膜癌细胞HEC-1A;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot 检测转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA和蛋白表达。采用MTT法观察转染Lumican基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力。结果：重组质粒pEGFP-N1-Lumican经HindⅢ和BamHⅠ酶切,获得8311 bp片段和865 bp插入片段,序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致;荧光显微镜下可见转染的HEC-1A细胞有绿色荧光蛋白的表达;转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA表达上调,Lumican蛋白相对上调率为74．62％（P＜0．05）。与对照组细胞比较,转染Lumican 基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的抑制率为21．35％±2．78％。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Lumican,该载体在体外能有效抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力,为以Lumican基因为靶点研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A的恶性生物学特性提供实验基础。     

龙竹和麻竹FT同源序列的扩增与序列分析

根据拟南芥Flowering Locus T（FT）基因和水稻Heading date 3a（Hd3a）基因的序列设计引物,通过PCR扩增的方法分别从麻竹和龙竹基因组DNA中各得到长为334bp的DNA片段.经BLAST检索、基因结构分析和编码蛋白功能域预测等分析,初步确定所得DNA片段可能是麻竹和龙竹中的FT同源基因的部分序列.     

双歧杆菌介导的福氏志贺菌Bb-ipaB疫苗的构建

目的：构建福氏志贺菌重组双歧杆菌Bb-ipaB疫苗。方法：以福氏志贺菌DNA为模板扩增福氏志贺菌ipaB基因,双酶切后克隆到pGEX-1λT质粒上,构建重组质粒pGEX-ipaB,电穿孔法将该质粒转化入Bb,构建福氏志贺菌重组Bb-ipaB疫苗。结果：成功扩增出分子量约为1 711 bp的ipaB基因,双酶切证实基因成功插入pGEX-1λT中,并成功转化入双歧杆菌,构建rBb-ipaB疫苗。结论：成功构建福氏志贺菌重组rBb-ipaB疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒(NDV)ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

山东德州市鸡源隐孢子虫种类的分子鉴定

根据禽源隐孢子虫GP20基因,设计1对保守引物和1对特异性引物,建立巢氏PCR检测方法,并进行验证.该巢氏PCR能特异性地扩增出496bp的禽源隐孢子虫基因组DNA中相应片段,最低能检测到0.52fg的阳性参照DNA.建立的巢氏PCR方法具有高度的特异性和敏感性,可以用于样品的检测.通过该方法鉴定山东省德州地区养鸡场中感染鸡的隐孢子虫种类为C.baileyi,感染率为31.5%.     

猪干扰素基因的克隆与原核表达载体的构建

干扰素(Interferon)是一种广谱抗病毒剂,具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种作用而被广泛应用于病毒性疾病的预防和治疗。本实验以猪肝脏组织为材料,提取猪肝脏组织DNA,根据Gen Bank收录的猪干扰素基因序列设计特异性引物,以猪肝脏DNA为模板进行高保真扩增得到IFN基因的ORF片段,然后进行了T载体克隆。再利用引入Eco RⅠ、SalⅠ酶切位点的特异性引物对IFN成熟肽段的基因进行亚克隆,经双酶切、连接、转化后,成功构建了p ET28a-ifn原核表达重组质粒,为干扰素基因的原核表达奠定了基础。     

小麦基因组原位杂交技术的影响因素分析

采用切口平移法标记外源物种(黑麦)总基因组DNA作为探针,用受体物种总基因组DNA(中国春小麦)作遮盖,对小麦1B/1R易位系中外源染色体的黑麦易位片段进行检测。对影响基因组原位杂交技术实验效果的因素进行了分析。通过实验认为:细胞分裂相多、染色体分散良好、染色体长度适中的高质量染色体制片是取得理想实验效果的基础;保证在整个实验过程中染色体一直附着在载玻片上不丢失是实验进行的支撑条件;探针DNA与封阻DNA的比例是取得理想实验效果的关键。对杂交信号过多或过少或者无杂交信号的技术环节进行了分析,并提出了解决办法。实验过程中应严格控制每一步骤,才能获得理想的原位杂交实验效果。     

南阳牛血液基因组DNA提取与ANGPTL4基因的PCR扩增

采集20例南阳牛的血液,采用酚/氯仿法分离白细胞提取基因组DNA,并且对ANGPTL4基因部分序列(677～998 bp)PCR扩增条件进行了优化。结果表明,获得的牛基因组DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,主条带清晰,表明获得的南阳牛基因组DNA可以用于后续实验;以所提取的基因组DNA为模板,优化ANGPTL4基因片段扩增的条件,结果表明,最理想的PCR扩增条件是模板量为2μL(50 mg/L),Taq聚合酶(5 u/μL)的量为0.8μL,退火温度为56℃,循环次数为35次。     

珙桐rbcL基因的克隆与序列分析

根据已知植物rbcL基因设计引物,以珙桐叶片总DNA为模板,PCR扩增目的DNA片段,克隆入pDM19-T载体.阳性克隆鉴定后进行测序,序列分析结果表明:该基因片断长为1266 bp,包括1031 bp的编码区序列,编码343个氨基酸;其编码区氨基酸与烟草、菠菜、玉米、甘薯、拟南芥、水稻、葡萄、地钱和葡萄柚等9个物种的同源性94.13%以上,并构建了它们间的亲缘关系树.该基因片断的预测晶体结构与菠菜的最相近,推测Lys86、Lys60、Lys179等残基对酶的活性影响较大.     

应用显微注射法建立免疫耐受转基因小鼠模型的研究初探

本论文用质粒载体PBC1-CD152转化大肠杆菌DH5a，以Amp(50mg／m1)筛选阳性单个菌落，LB培养基大量培养，按照质粒小量提取试剂盒使用方法抽提质粒，AVAⅠ、HindⅢ酶切和PCR扩增检测。可育雌鼠注射PMSG与HCG超排卵，输卵管内收集，移植受体母鼠输卵管腹壶部。结果表明：AVAⅠ酶切产物有一条为2．0kb的片段，证明是目的基因的启动子，从而证明质粒上含有我们所需的目的基因片段。HindⅢ酶切后出现一条带，与质粒的大小相符。共处理十批小鼠100只，有70只为可用供体，处理有效率为。70％，共捡胚1425枚，只均捡卵20．36枚。共处理受体小鼠十批40只，每只植入胚胎20枚，共出生小鼠274只，出生率为34．25％。本次实验成功扩增了免疫耐受诱导基因皮肤靶向表达载体PBC1-CD152，并以小鼠为动物模型，建立了完善的显微注射法转基因技术流程。     

人C6orf210基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。     

一道生物学高考题的分析与启示

1试题(2011天津理综第6题)某致病基因h位于X染色体上,该基因和正常基因H中的某一特定序列BclI酶切后,可产生大小不同的片段(如图1,bp表示碱基对),据此可进行基因诊断。图2为某家庭病的遗传系谱。     

应用mRNA差异显示技术筛选磁螺菌MSR-1磁小体合成相关基因

为寻找Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1中与磁小体合成相关的基因,实验利用氧气浓度对MSR-1生长的影响,应用m RNA差异显示技术筛选与磁小体合成相关的c DNA片段,经测序后获得7条差异片段序列.共得到M-1,M-2,…,M-7共7条差异片段,然后进行生物信息学分析.片段M-2和片段M-3推测蛋白质均含有保守结构域Mqs R,根据Mqs R对生物膜形成有重要调节作用推测此片段可能与磁小体外膜的形成有关.其中M-4推测蛋白质具有保守结构域rpo H2,推测此片段编码的蛋白质可能是识别MSR-1中磁小体合成相关基因起始位点的酶.片段M-5推测的蛋白质具有PPK2超家族和ALDH-SF超家族,推测片段M-5编码蛋白质的功能可能是为磁小体提供能量.片段M-6,M-7编码蛋白质推测功能可能也是为MSR-1合成磁小体提供能量.     

一种H7N9禽流感病毒检测质粒DNA标准物质的研制

为保证H7N9禽流感病毒核酸检测方法的可比性、有效性和可靠性,研制了一种质粒DNA标准物质,包含H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的靶标基因(H7、N9基因序列)和内参基因(M基因、Rnase P基因序列),具有良好的序列准确度和量值溯源性。采用紫外分光光度法(UV)和高分辨电感耦合等离子对该标准物质的均匀性、稳定性进行了评估,并对定值不确定度进行了评定。结果显示,质粒DNA标准物质量值可靠,均匀性和稳定性良好,可以在-20℃下保存1 a以上,且无生物危害。对质粒DNA标准物质在实时荧光RT-PCR检测中的应用性考察结果证明,其适用于多种实时荧光RT-PCR检测方法,可保证H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测结果的可比性,为其提供生物计量技术支持。     

用RAPD技术鉴定烤烟抗赤星病基因连锁标记

用49个RAPD引物对烤烟13个抗赤星病品种和15个感赤星病品种基因组DNA进行RAPD分析，找到了一个和烤烟抗赤星表型密切相关的DNA片段，此片段长750bp，命名为S220－760。通过对长勃黄和净叶黄的RAPD分析表明，S220－760为13个抗病品种所共有和15个感病品种没有。因此，S220－760可作为烤烟抗赤星病基因紧密连锁的RAPD标记。这为下一步钓取烤烟赤星病基因的工作打下了基础。