果蝇EF-1α蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为进一步研究延长因子-1（elongationfactor-1α,E-1α）在调控心脏发育和果蝇心脏功能中发挥的作用,制备延长因子-1的抗体．利用生物信息学选择果蝇EF-1α基因抗原亲水区,并设计出特异性引物,PCR扩增出的片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E．coli中后通过IPTG诱导融合蛋白表达,将His—EF-1α融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,再用WesternBlot检测抗体的效价和特异性．研究结果表明,获得了EF-1α原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗EF-1α多克隆抗体．EF-1α多克隆抗体的效价可以达到1比1500,并且有很强的特异性,为后续研究EF-1α基因在心脏发育和心脏功能中的作用奠定了基础．     

小鼠nulp1基因多克隆抗血清的制备及检测

为了在小鼠模型中更深入地研究nulp1蛋白在心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出小鼠nulp1基因的部分编码区并连接入pET-28a表达载体中,之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)通过IPTG诱导表达Hisnulp1融合蛋白,对该融合蛋白采用Ni-IDA凝胶柱层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,并用western blotting对抗体进行分析.结果表明,获得了高效价的特异性兔抗nulp1多克隆抗体.这为nulp1功能的进一步研究奠定了基础.     

人Rab7基因的原核表达与多克隆抗体制备

利用RT—PCR技术从HEK293细胞中克隆到人Rab7基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliDH5α感受态细胞,获得阳性克隆．24℃下IPTG诱导表达,Glutathi—one Sepharose 4B纯化后获得高纯度的Rab7蛋白．并以此为抗原免疫小白鼠,获得了Rab7的特异性抗体．     

褐飞虱flightin基因多克隆抗体的制备及应用

为探讨不同翅型和龄期褐飞虱体内的flightin蛋白表达情况,通过Gateway重组技术构建原核表达载体pDEST17-flightin,以终浓度为1mmol/L的IPTG诱导的蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。Western blotting检测表明,制备的flightin抗体可特异性地检测褐飞虱体内的flightin蛋白。间接ELISA检测结果表明,所制备的抗体效价达1∶6 400。flightin蛋白在褐飞虱长翅成虫中大量表达,在短翅雄虫中也检测到有微量表达,而在短翅雌虫和若虫中则检测不到。     

柑橘黄龙病菌CpaB基因的原核表达和抗体制备

柑橘黄龙病菌CpaB基因编码一种菌毛组装蛋白(Flp pilus assemble protein),前期研究已经证实该蛋白具有外分泌性.在本研究中,首先构建pET30a-CpaB重组载体,然后将其转化BL21(DE3)感受态细胞,重组菌在37℃,0.2 mmol·L^(-1) IPTG诱导下,CpaB蛋白可被成功诱导表达,经过Ni-NTA亲和柱纯化后,获得纯度较高的CpaB重组蛋白,分子量为28.2 kDa,以其为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗血清;采用Western blot对多抗血清的特异性进行分析,结果显示该多抗能特异性结合纯化的CpaB蛋白;进一步使用制备好的CpaB抗血清对感染黄龙病和健康的柑橘样品进行DTBIA检测,具有较好的区分度.这些研究结果为柑橘黄龙病快速检测体系的建立提供理论参考.     

水稻内源木聚糖酶osx基因的克隆及表达分析

为进一步了解植物内源木聚糖酶基因结构及其表达特性,从水稻中克隆和表达了一种内源木聚糖酶基因。通过序列比对分析确定保守区序列,以PCR扩增得到的保守区序列从众多水稻木聚糖酶预测序列中"钓取"可能的目标基因,并以此基因为模板设计引物,通过RT-PCR扩增得到一条长度为1 443 bp的基因片段osx,测序结果与水稻木聚糖酶基因预测序列NM_001061680一致性高达99%,该序列编码480个氨基酸,经预测不存在信号肽序列。构建表达载体pET28-a(+)-osx,导入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,该表达产物未检测到木聚糖酶活性。受大麦和玉米内源木聚糖酶基因表达的前体为无活性蛋白需要剪切加工的启示,进一步通过在线蛋白同源建模分析,设计引物去掉蛋白N端约120个氨基酸,C端约40个氨基酸,保留"Glyco-hydro-10"结构域,使其成功实现了原核活性表达,表达蛋白约40 kDa,木聚糖酶活性为11.53 IU/mL。     

抗雌激素多克隆抗体的制备及效价鉴定

为了快速安全地检测动物性食品中是否含有过高浓度雌激素,本研究将半抗原雌二醇(Estradiol, E₂)合成为雌二醇-3-羧甲基醚(E₂-3-CME),再通过碳二亚胺(EDC)法与牛血清白蛋白(BSA)结合,合成完全抗原(E₂-BSA).将1 mg/只的E₂-BSA免疫雌性家兔,制备出抗雌激素的抗体.通过用酶联免疫吸附(Elisa)实验对产生的抗体进行效价鉴定.实验结果表明,第三次免疫后E₂-BSA产生的抗体光密度值(OD)最高,且与对照组,免疫一次和两次产生的抗体的OD值均具有明显差异,显示通过抗原免疫三次的家兔产生的抗体效价最高,可为后期通过此方法制备抗体和Elisa试剂盒奠定基础.     

差别表达基因片段的克隆策略

克隆差异表达的基因可为分化细胞与祖细胞、激活细胞与静止细胞、突变细胞(如肿瘤细胞)与正常细胞提供某些有意义的信息，本文综述了差异表达基因克隆的一些策略。     

昆虫神经毒素AaIT原核表达、纯化及抗体制备

人工合成Aa IT的成熟基因,连接到p ET32载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化重组Aa IT蛋白并免疫小鼠,经蛋白质-G柱对抗血清进行纯化.研究结果表明,纯化得到了Aa IT蛋白经免疫小鼠和纯化抗血清得到了特异性强的Aa IT抗体蛋白.     

甲壳动物卵黄蛋白原基因的分子克隆和表达研究进展

对近年来甲壳动物卵黄蛋白原基因的分子克隆和该基因在体内表达研究等方面进行分析,显示甲壳动物卵黄蛋白原的cDNA及其推断的氨基酸序列有很高的相似性,且有类似的分裂位点.卵巢和肝胰腺是甲壳动物卵黄蛋白原基因表达的主要位点.     

植物胚胎发育过程中基因表达调控的研究进展

植物胚胎的发育是一具有次序的、选择性的基因表达过程。本从胚胎的极性建立、形态建成、分生组织形式、胚体发育等方面，对基因表达调控的研究进展作了一些简要介绍。     

抗体药物的研究进展

随着人们对抗体的结构与功能的了解不断深入,抗体不仅在抵抗外来生物物质方面有着重要作用,而且利用它本身的特点来防治疾病更是人们的研究热点。特别是单克隆抗体技术的问世,使得研究和生产单抗药物成为现实。本文就单抗药物的历史、现状、存在的问题及未来展望做一简要综述。     

鹅MYL1基因的克隆及胚胎期表达特征分析

肌球蛋白是肌纤维的主要组成成分,在肌肉生长和收缩过程中具有重要作用.本研究以鹅（Anser anser）肌肉总RNA为模板,采用RACE的方法,克隆肌球蛋白轻链1（MYL1）基因全长cDNA序列,并进行生物信息学分析.运用实时荧光定量PCR检测MYL1基因在鹅胚胎期的表达特征.结果表明,鹅MYL1基因全长cDNA为1542 bp,编码193个氨基酸残基的肽链.预测鹅MYL1蛋白等电点5.12,分子量21.75 KD,具有典型的EFh和FRQ1结构域,且不同物种间EFh氨基酸序列高度同源.荧光定量PCR结果显示鹅胚胎期MYL1基因mRNA表达量总体呈现上升后下降的趋势,该基因在胚胎期E7就有表达,E7以后表达量逐渐上升,在E18表达量达到高峰后下降.研究结果首次提供了鹅肌肉组织主要结构基因MYL1的全序列和蛋白特征信息,并揭示该基因在鹅肌肉组织发生和发育的功能.     

基因的发现历程

以基因发现历程为线索,分别从基因的结构、基因的复制、基因的表达、基因的调控、基因的突变等角度对生命遗传问题进行了回答,旨在加深对基因的认识,并学习前人对科学的探索精神.     

人神经生长抑制因子的单克隆抗体制备及抗原决定簇的研究

神经生长抑制因子（ＦＩＦ）是一种特异存在于哺乳动物脑中的金鹰硫蛋白 （ＭＴ），又称ＭＴ－Ⅲ，具有特异神经细胞生长抑制效应．ＭＴ－Ⅲ与ＭＴ有７０％的序列 同源性，但ＭＴ却无此功能．在患ＡＤ症病人的大脑中，ＧＩＦ和ｍＲＮＡ的含量均显著降 低．为了进一步研究，ＭＴ－Ⅲ的结构与功能及与ＡＤ症的关系，制图示ＧＩＦ的单克隆抗 体，用ＥＬＩＳＡ方法研究了ＧＩＦ，α－结构域和β－结构域，Ｎ－末端六肽和Ｎ－末端＋肽分别 与ＧＩＦ的单克隆抗体的相互作用，并对单克隆抗体的抗原决定簇进行了分析．结果显示 了ＧＩＦ的抗原决定簇与其一定的空间构象有密切的关系．     

中药中活性物质单克隆抗体的制备及其免疫检测应用

中药活性成分检测是中药质量控制的关键环节,但中药中许多重要活性物质如甾体皂苷、多数三萜皂苷和大多数真菌中的多糖化合物光谱吸收只有弱的末端吸收甚至无特征紫外吸收,分析、检测比较困难.在单克隆抗体技术基础上的小分子化合物的免疫学检测可应用于这些活性成分化合物的快速检测以及研究其在体内的代谢和分布.该方法与传统检测方法相比,省时、便携、易操作,将在中药材标准研究上发挥更大的作用.     

肉鸡IGF-I基因mRNA的时空表达模式

采用实时荧光定量PCR技术,以β-actin为内参,检测了白羽AA肉鸡在4周龄时其胸肌、腿肌、脂肪、心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肌胃、肠、脑共12个组织和在1日龄及1、2、3、4、5、6、7周龄时腿肌、肝脏、脂肪中类胰岛素生长因子-I（IGF-I）的表达量变化。结果显示,除肾外其余组织均表达一定量的IGF-I mRNA表达,且在肝脏中表达量显著高于其他组织;腿肌6周时IGF-I mRNA表达量达到最大值,其余各时期也都高于1日龄时的表达;肝脏中表达量最高时期是3周,然后又呈下降趋势;脂肪中在3周时表达量最高,然后其表达量随年龄增长而逐渐下降。本实验结果揭示了生长早期肉鸡IGF-I基因mRNA的时空表达特征,为进一步研究生长轴相关基因对肉鸡早期生长发育的调控作用奠定了基础。     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该1条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明：该基因为放线菌来源chs基因．分别在该基因5＇末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoRI酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple—T／chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点（PI）为5．41、分子量为3965道尔顿含有cHs保守功能区的酸性蛋白质．分析表明,该基因与Streptomyceslividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87．70％．测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中．