绿僵菌Argonaute基因片段原核表达载体的构建及其表达

绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌.研究表明小RNA能够调控基因的表达,其中Argonaute基因在整个小RNA通路中发挥重要的作用.本研究通过RT-PCR的方法从绿僵菌中获得了Argonaute基因的部分功能片段,构建了其重组原核表达载体,将重组载体转化至大肠杆菌进行诱导表达;采用镍柱亲和纯化重组的目的蛋白并通过Western blot技术鉴定.结果发现：通过RT-PCR的方法获得长度约为950bp的基因片段;重组原核表达载体经诱导表达后,SDS-PAGE检测发现分子量约为34kDa的目的蛋白条带;诱导5h后蛋白的表达量最高,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,经Western blot技术检测,重组蛋白可与His-tag抗体发生特异性反应.该纯化重组蛋白的获得为将来绿僵菌Argonaute蛋白抗体的制备,并进一步通过该抗体获得绿僵菌体内的小RNA及其靶基因提供了基础.     

Cloning, expression, purification, and characterization of LC-1 ScFv with GFP tag

INTRODUCTION Because of its low molecular weight and ability to fluoresce independently (George, 1997), the new molecular tag, green fluorescent protein (GFP), has become more and more popular after Prasher et al.(1992) cloned its cDNA in 1992. There are many reports describing the co-expression of GFP and a specific antibody or cytokine gene, with the fusion protein expressing the fluorescent activity and bio-logical activity of the complement protein (Haraguchi et al., 1999; Mclean…     

IEEE 802 1Q VLAN原理实验的设计与实现

VLAN原理实验利用协议分析方法,测试验证VLAN实现的功能,以及交换机不同属性端口接收、转发普通帧和标记帧的特性,观察支持VLAN的交换机对以太帧插入、删除802.1Q标记的过程。并通过错误配置交换机端口属性,演示交换机加、去标记失配导致的网络故障,以加深学生对IEEE 802.1Q VLAN原理的理解。     

紫外照射对大肠埃希氏菌质粒DNA影响的研究

本研究对大肠杆菌进行紫外照射诱变后,获得了通过其内部的SOS修复系统产生的突变菌株,采用异丙醇沉淀法对各组菌种进行质粒DNA提取.通过测定各组OD值,经过比较与分析得出了经紫外处理10min后的大肠杆菌质粒DNA浓度最高,为215ug/ml,其次为正常组的190ug/ml.经紫外照射30min后的大肠杆菌质粒DNA浓度最低,仅为65ug/ml.紫外处理时间与质粒DNA浓度整体呈现下降趋势.初步推测是由于大肠杆菌SOS修复系统的RecA蛋白促进了不完全同源的DNA序列之间的重组,产生大量的错配碱基,从而引起突变,进而影响到其质粒DNA的浓度.     

假单胞茵产弹性蛋白酶基因的克隆与表达

从假单胞菌（Pseudomonassp．）XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌（Escherichiacoli）中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框（0RF）克隆至融合表达载体pET30a（＋）进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E．coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20％;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性．     

果蝇血液发育标记基因Dox-A3多克隆抗体的制备

从野生型成体果蝇体内提取总RNA,以cDNA作为模板进行PCR扩增,获取Dox-A3部分基因片段,将这片段连接于原核表达载体pET-28a上,成功构建重组质粒pET-28a-Dox-A3.将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,用ITPG诱导表达出融合蛋白,然后将经Ni-IDA凝胶柱纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备Dox-A3多克隆抗体,通过Western-Blot检测效价和特异性.结果表明,实验获得了高质量的多克隆抗体.     

骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达与纯化

骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein,BMP-2）具有多种生物活性,有潜在的药用价值.为探索利用基因工程技术重组BMP-2并在大肠杆菌表达系统表达的可行性.在大肠杆菌中重组和筛选BMp-2基因,SDS-PAGE电泳分析,显示外源蛋白带在相对分子量约12kD处,以离子交换层析DEAE和分子筛纯化蛋白,缓慢复性并在C2C12细胞内检测到其蛋白活性.     

基于物联网环境的RFID安全协议设计

物联网环境下的RFID系统中标签数目众多,读写器面临着同时阅读、修改多个标签的状况。在保障个人隐私和信息安全的前提下,加快标签的识别和信息的读取,降低系统时间开销,具有重要意义。文章通过对RFID安全协议的改进,在系统中采用双密钥技术,提高了服务器与标签之间的认证效率,实现了认证的快速性和信息的安全性。     

SEB超抗原受体拮抗剂在大肠杆菌中的高效可溶性表达、纯化及活性初步研究

目的:在大肠杆菌(BL21)中构建可溶性表达的金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)受体拮抗剂。方法:首先确定SEB受体桔抗剂的基因序列,然后用含有SEB受体桔抗剂的基因序列重组质粒表达载体PGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达获得蛋白,产物经GST柱纯化后,利用ELISA检测其与SEB的结合能力并进行其体内外药效学实验。结果:该质粒成功转化为可溶性表达,ELISA结果显示表达产物可与SEB特异性结合。结论:本研究成功对SEB受体拮抗剂GST可溶性表达并对其活性进行初步分析。     

猴源溶组织内阿米巴原虫巢式PCR检测方法的建立

目的:建立猴源溶组织内阿米巴原虫巢式PCR检测方法并初步应用于临床检测;方法:根据溶组织内阿米巴原虫16S r DNA基因序列,设计1对阿米巴属原虫保守引物和1对溶组织内阿米巴原虫特异性引物,建立猴源溶组织内阿米巴原虫巢式PCR检测方法,摸索出了该检测方法的最佳反应条件,进了行特异性和敏感性试验,并对96份猕猴粪便样品进行检测;结果:该巢式PCR方法能特异性地扩增出猴源溶组织内阿米巴原虫目的片段,与莫氏内阿米巴、波氏内阿米巴、迪斯帕内阿米巴、大肠内阿米巴、微小隐孢子虫等11种相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到0.3 fg的阳性参照DNA;对临床样品检测结果表明该PCR技术检查阳性者显微镜检查均为阳性;结论:建立的巢式PCR方法具有高度的特异性和敏感性,对于溶组织内阿米巴原虫病的诊断和流行病学调查具有重要的应用价值。     

西方蜜蜂一个新表皮蛋白基因的克隆和结构分析

利用西方蜜蜂雄蜂头部5’LongSAGE文库中的一组标签序列,在蜜蜂基因组序列第9号连锁群上定位一个新的西方蜜蜂表皮蛋白基因转录起始位点,并克隆了该基因的eDNA序列,继而利用此cDNA序列分析了该基因的内含子和外显子结构．分析结果显示：该基因的DNA序列长1253bp,含有4个外显子和3个内含子,其cDNA长598bp,编码一个169AA的富含Val和Pro残基（23．67％,20．12％）多肽序列．BLAST分析发现,该蛋白与已知的4个昆虫表皮蛋白序列的相似性为47．54％,且其C末端有一个共有基序,说明这5个蛋白可能属于同一个表皮蛋白家族．该研究结果提供了一个新的蜜蜂表皮蛋白基因,且该基因在雄蜂头部表达水平较高．     

斑节对虾酚氧化酶原在大肠杆菌中的表达

将斑节对虾酚氧化酶原（prophenoloxidase,proPO）基因克隆进pET28a（＋）,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析均能检测到一条分子量为79．4kDa的特异性条带,与推导的融合蛋白理论分子量82．4kDa基本相符;包涵体变性后对经Ni—NTAagarose纯化的变性液进行复性,表现出0．3851U／mg．min的PO活性;不同条件下的诱导表达结果显示,18℃时诱导培养能检测到目的蛋白的可溶性表达,经诱导9h后可溶性表达比例达到最高,约占菌体可溶性蛋白总量的s．56％;可溶性表达的目的蛋白纯化后经胰酶消化,可检测到分子量为60kDa、42．7kDa的特异性条带,并表现出0．4249U／mg．min的PO活性．     

汉语附加问句话语功能的历时演化与发展

从历时视角考察汉语附加问句的三大基本话语功能,在该句式发展的不同阶段和不同的情境语义条件下,有着不同的凸显度和具体内涵。具体表现为:附加问句产生缘起即"概念功能"导向→附加问句主观肯定性增强即"语篇功能"导向→附加问句深度主观化即"人际功能"导向。可见,汉语附加问句不仅语法结构是动态的、浮现的,而且其所具有的话语功能也是动态的、发展的,也会因语言的不断运用而不断变化、发展与丰富。同时,运用动态、发展的眼光考察语法结构的话语功能,有助于更深入地阐释语法结构主观化和语法化进程的功能需求动因。     

蛋白质空间结构的统计分析

利用数据挖掘中的数据分布拟合理论对生物科学领域中的蛋白质侧链空间结构进行统计分析.以世界上广泛使用的生物分子三维结构数据库PDB为基础,利用沈世镒教授提出的对多氨酸残基侧链碳原子间距离的统计分析方法,通过正交试验设计和信息论中的熵函数等相关知识,给出了不同位置、不同氨基酸残基种类对侧链结构的影响.     

Effects of medium composition on the production of plasmid DNA vector potentially for human gene therapy

INTRODUCTION The difficulties associated with large-scaleproduction of biotherapeutics provide a constantchallenge to the biotechnology industry. FDA hadadded “therapeutic DNA plasmid vectors” to the listof well-characterized biotechnology product (DoHHs,1996), and gene therapy has moved rapidly fromlaboratory scale to clinical trials. It is urgent to de-velop new protocols to obtain high-quality plasmidswith high yields and minimal or no contamination ofRNA and chromosomal D…     

Cloning and GST-fused expression in E. coli of mouse β-1,4-galactosyltransferase

INTRODUCTION b-1,4-galactosyltransferase (b4Gal-T) (EC 2.4.1.38), as one of the most researched glycosyl-transferases in recent years, produces a b-1,4-linked galactosylated glycan by the transferation of ga-lactose (Gal) from an uridine diphosphate-galactose (UDP-Gal) to a monosaccharide N-acetylglucosa- mine (GlcNAc) or a GlcNAc residue located in the non-reducing terminal of glycans of glycoproteins or glycolipids. In addition to GlcNAc, the enzyme can also use other reducing su…     

亲和色谱法从融合蛋白GST-IL-6中纯化重组人白细胞介素-6

研究用亲和融合谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)的方法纯化重组人白细胞介素 6(IL 6)的发酵和纯化工艺 ,使用含有质粒pHZl818的E .coliJMl0 9在 2XYT培养基中进行发酵表达 ,IL 6表达为与谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合的融合蛋白GST IL 6.融合蛋白存在可溶的活性蛋白和不可溶的包含体两种形式 ,此包含体无活性且无法复性 ,无法用亲和层析回收 ,通过实验优化摇床发酵的诱导温度和转速 ,以增加可溶融合蛋白的表达 .菌体超声破碎液后 ,上清液用作亲和柱层析 ,可将融合蛋白提纯至 80 00 ,每升发酵液可得 10mg融合蛋白 ,用凝血酶裂解处理 6h ,亲和标志物GST被特异性切除 ,裂解得到的IL 6用离子交换柱层析可纯化至 95 00 ,MTT法测得纯化的IL 6生物学活性为 1.0 2× 10 8IU/mg .     

小鼠nulp1基因多克隆抗血清的制备及检测

为了在小鼠模型中更深入地研究nulp1蛋白在心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出小鼠nulp1基因的部分编码区并连接入pET-28a表达载体中,之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)通过IPTG诱导表达Hisnulp1融合蛋白,对该融合蛋白采用Ni-IDA凝胶柱层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,并用western blotting对抗体进行分析.结果表明,获得了高效价的特异性兔抗nulp1多克隆抗体.这为nulp1功能的进一步研究奠定了基础.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

将人细胞周期蛋白D1基因克隆入原核表达载体pET-20b中获得重组质粒pET-20b-eyeD,经酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21PlaysS后获得表达菌株．该菌株经IPTG诱导后表达的目的蛋白有部分分泌到培养基上清中,将培养基上清中的蛋白沉淀后用Ni^2＋螯合柱进行纯化,最后可得到纯度达到95％以上的目的蛋白．蛋白电泳显示纯化蛋白的分子量约为33KD,Westemblot分析表明,在电泳胶的相应分子量处出现特异性条带,说明已经成功表达和纯化了重组人细胞周期蛋白D1．