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超嗜热菌Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶(αβ-LeuRS) 是已知的唯一的双肽链LeuRS。通过αβ-LeuRS和大肠杆菌LeuRS相应肽段的重组和重组酶性质的研究发现,αβ-LeuRS的α亚基C末端36个氨基酸对于αβ-LeuRS的氨基酰化活力至关重要。αβ-LeuRS的两个亚基人为融合得到的单亚基酶SLeuRS-αβ,具有完全的野生型双亚基酶活力,其热稳定性显著增强。同时,通过亚基重组揭示了LeuRS 对于不同种属的tRNALeu的识别元件位于α亚基内,而其中的CP1 结构域不仅是LeuRS 行使编校功能的结构基础,对于LeuRS识别不同种属来源的tRNALeu 也是十分重要的。通过不同来源的LeuRS一级结构比较,克隆了单独的CP1结构域组成的肽(CP1),发现唯有A. aeolicus αβ-LeuRS 的CP1对错误的氨基酰化产物具有体外编校功能。它与其它3种来源于细菌LeuRS的CP1都能够编校误氨基酰化的古老形式的亮氨酸小螺旋 (minihelixLeu)。通过同源序列比较发现,在αβ-LeuRS的CP1内存在一个由20个氨基酸组成的特异的结构模体,它对CP1发挥体外编校功能必不可少,引入原本不具有体外编校功能的E. coli的CP1 后则可使其获得编校功能,但是该模体不影响全酶的编校功能。αβ-LeuRS中与tRNA结合有关的亚基－β亚基也可以赋予E. coli CP1编校功能。这些研究结果充分表明,来源于古老的超嗜热菌A. aeolicus 的αβ-LeuRS 保留了进化的遗迹－具有编校活力的CP1和与其编校功能密切相关的由20个氨基酸组成的特异的结构模体,它们在进化过程中随着其它结构域招募进合成酶中而逐渐失去了对全酶编校功能的作用。这一发现有力地支持了aaRS通过纳入新的结构域以加速进化过程的理论,并且也从不同角度为aaRS/tRNA共进化理论提供了可靠的依据。 相似文献
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超嗜热菌Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶(αβ-LeuRS) 是已知的唯一的双肽链LeuRS。通过αβ-LeuRS和大肠杆菌LeuRS相应肽段的重组和重组酶性质的研究发现，αβ-LeuRS的α亚基C末端36个氨基酸对于αβ-LeuRS的氨基酰化活力至关重要。αβ-LeuRS的两个亚基人为融合得到的单亚基酶SLeuRS-αβ，具有完全的野生型双亚基酶活力，其热稳定性显著增强。同时，通过亚基重组揭示了LeuRS 对于不同种属的tRNALeu的识别元件位于α亚基内，而其中的CP1 结构域不仅是LeuRS 行使编校功能的结构基础，对于LeuRS识别不同种属来源的tRNALeu 也是十分重要的。通过不同来源的LeuRS一级结构比较，克隆了单独的CP1结构域组成的肽(CP1),发现唯有A. aeolicus αβ-LeuRS 的CP1对错误的氨基酰化产物具有体外编校功能。它与其它3种来源于细菌LeuRS的CP1都能够编校误氨基酰化的古老形式的亮氨酸小螺旋 (minihelixLeu)。通过同源序列比较发现，在αβ-LeuRS的CP1内存在一个由20个氨基酸组成的特异的结构模体，它对CP1发挥体外编校功能必不可少，引入原本不具有体外编校功能的E. coli的CP1 后则可使其获得编校功能，但是该模体不影响全酶的编校功能。αβ-LeuRS中与tRNA结合有关的亚基－β亚基也可以赋予E. coli CP1编校功能。这些研究结果充分表明，来源于古老的超嗜热菌A. aeolicus 的αβ-LeuRS 保留了进化的遗迹－具有编校活力的CP1和与其编校功能密切相关的由20个氨基酸组成的特异的结构模体，它们在进化过程中随着其它结构域招募进合成酶中而逐渐失去了对全酶编校功能的作用。这一发现有力地支持了aaRS通过纳入新的结构域以加速进化过程的理论，并且也从不同角度为aaRS/tRNA共进化理论提供了可靠的依据。 相似文献
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第一部分:为得到大量的大肠杆菌tRNALeu1和tRNALeu2,研究tRNA与亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)的相互作用,用基因克隆的方法高表达并纯化了它们;测定了接受活力和被LeuRS催化的动力学常数;改进了RNA体外转录必需的T7RNA聚合酶的纯化方法,优化了转录条件,转录序列比文献值高10倍.用体外转录方法得到了各种在接受茎突变的tRNALeu变种,研究了一个在CP1结构域插入40个氨基酸残基的变种LeuRS-A对tRNALeu2种等受体的识别,证明了tRNALeu1和tRNALeu2接受茎上的第一对硷基对是否摆动是LeuRS-A识别的关键.第二部分:在大肠杆菌中高表达头孢菌素酰化酶基因10倍以上.研究了它的α-亚基的N-端变化(LAEP…→MGIP…)对酶学动力学常数的影响.构建了带有不同抗菌素抗性和启动子的高表达质粒,研究了它们表达的特点,分析了这些质粒的不同用途.用含有编码该酶两个亚基的基因的相容质粒共转化的方法.研究了它们在体内的重组和前体的加工.研究结果表明,该酶可能属于一类新的N-端亲和水解的酰化酶. 相似文献
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